引物合成知识资料-赛百盛,金斯瑞

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1、化学合成的Oligo用于克隆须知（赛百盛）不管化学合成的OligoDNA为短片段还是长片段，只要用于PCR克隆，最好对OligoDNA粗制品进行纯化。尽管如此，客户还是须考虑如下风险：    1.内部缺失（n-1，n-2etc）产物。这是化学合成DNA最普遍与最主要的限制因素，且不能通过纯化OligoDNA来解决这个问题。化学合成DNA不及活细胞内DNA复制具有高保真性，在活细胞内，存在大量的校正与修复系统，将碱基突变率降低至1/(1×106)甚至1/(1×109)以下。PCR反应也具有较高的保真度，例如：错误率在1/1000或1/10000。PCR反应

2、可通过DNA聚合酶的性能提高保真度。但是化学合成DNA与活细胞及PCR反应扩增DNA不同，每次合成循环的错误率约为1/100，主要包括以下几方面的因素。    (1)OligoDNA的化学合成是碱基与碱基之间通过化学反应偶联而成，而化学反应的偶联效率一般在99%左右，也就是说，在每次进行偶联反应时，都会有1%的DNA片段附加不上新的碱基，对这种截断的失败序列，为了防止其参与后续的偶联反应，采用CapA与CapB进行化学封闭，以阻断其延伸，但化学封闭反应的效率不可能达到100%。导致出现合成失败的DNA片段或截断序列残留在合成的DNA粗制品中。    (2

3、)OligoDNA的不完全脱保护。寡核苷酸的完全脱保护包括从磷酸酯基团、碱基上的环外氨基和5'-OH部分上去掉保护基团。脱保护的化学反应效率不可能达到100%，未脱保护的碱基无法参加偶联反应而导致oligoDNA内部缺失碱基。    (3)不断延长的DNA链与不断减少的合成试剂会干扰oligoDNA的化学合成。    对于以上三方面问题，至今为止还没有找到一个完美的试剂给予解决。因为延长盖帽时间也不能保证封闭反应效率达到100%；而对于脱保护反应来说，增加脱保护试剂量及延长脱保护时间又会导致oligoDNA脱嘌呤。因此只能采取折衷方法将不完全脱保护与脱嘌

4、呤同时控制在低水平上。内部缺失碱基的截断序列绝不可能100%去除干净，对于几种纯化方法来说，OPC或HPLC不可能去除内部缺失碱基的截断序列，最好的方法是通过PAGE纯化降低截断序列数量。    OPC与HPLC纯化法是通过两种不同形式的柱层析方法对oligoDNA进行纯化，PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化，但都不易将缺失一个碱基（n-1）或两个碱基（n-2）的oligoDNA与全长oligoDNA分离。柱层析与PAGE对于分析检测少量的oligoDNA是一种合适的手段，但作为纯化制备目的DNA片段，并不是非常有效。因此，在合成的目的o

5、ligoDNA中，总会存在少量的截断序列。由于这些错误的随机性（不同分子有不同的碱基突变，同时多数分子没有碱基突变），这种序列的错误率通常对普通PCR、测序或杂交不会存在问题，对于合成不太长的序列，更是如此。然而，克隆过程是单个oligoDNA分子的选择与扩增过程，若单个亲本分子存在序列错误，那么单克隆中所有分子都存在相同的序列错误。    2.单核苷酸的插入是存在于目的oligoDNA产物中的另一种常见的序列错误。   当同一oligoDNA分子中存在G-偶联或单碱基插入（n+1）同时又存在单碱基缺失（n-1）时，此条oligoDNA的长度与目的DNA

6、分子的长度相同，因此无法通过OPC、HPLC或PAGE纯化将此“失败序列”去除。    3.OPC、HPLC特别是PAGE是产率损耗很大的纯化方法，因此会导致低产量（OPC与HPLC的得率约为30%~50%，PAGE的得率约为10%~30%），主要的原因是大量的目的oligoDNA分子（全长与正确的OligoDNA）在纯化过程中会随着失败序列一起被去除。    OligoDNA化学合成存在的这些弊端曾被HeckerKH与RillR报道过（Erroranalysisofchemicallysynthesizedpolynucleotides.Biotech

7、niques,1998Feb;24:256-260）。在这篇文章中，作者合成并PAGE纯化了长链oligoDNA，用它们进行PCR克隆，然后测序鉴定了10个克隆，发现存在7个单碱基缺失，一个连续的4个碱基缺失，一个G-C替换。除了这些碱基错误，其它学者还曾报道存在G-偶联、分支及其n+x产物。    解决这些碱基出错的方法：  （1）对oligoDNA粗制品进行纯化。不仅要通过OPC、HPLC、PAGE等方法对OligoDNA进行纯化，而且需要优化化学合成方法来提高OligoDNA的纯度。   （2）当OPC、PAGE或HPLC纯化的OligoDNA用于

8、PCR克隆时，可能会存在一些序列错误的“突变”克隆（这些碱基错误的克隆可能源于O