几种PCR扩增地比较

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1、实用文档普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤普通PCR1概述聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction),简称PCR,是一种分子生物学技术,用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶(DNApolymeraseI)最早于1955年发现,而较具有实验价值及实用性的KlenowfragmentofE.Coli则是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所发现,但由于此酶不耐高温,高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应

2、。现今所使用的酶(简称Taqpolymerase),则是于1976年从温泉中的细菌(Thermusaquaticus)分离出来的。它的特性就在于能耐高温,是一个很理想的酶,但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制,它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制(类似PCR前两个周期反应)的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr.KaryB.Mullis发展出的,Dr.Mullis当年服务于PE公司,因此PE公司在PCR界有着

3、特殊的地位。Dr.Mullis并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。此后,PCR的运用一日千里,相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用,成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。2PCR原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时

4、间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新

5、链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。3.PCR反应体系与反应条件3.1标准的PCR反应体系10×扩增缓冲液10μl4种dNTP混合物200μl文案大全实用文档引物10~100μl模板DNA0.1~2μgTaqDNA聚合酶2.5μlMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水100μl3.2PCR反应五要素参加PCR反应的物质主要有五种即引物(PCR引物为DNA片段,细胞内DNA复制的引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2+)

6、。[PCR步骤]标准的PCR过程分为三步:1.DNA变性(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA2.退火(25℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。3.延伸(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′端延伸,合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和

7、延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度。4PCR反应特点4.1特异性强PCR反应的特异性决定因素为:②底物与模板DNA特异正确的结合;②碱基配对原则;③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性;④基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异

8、性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高。4.2灵敏度高文案大全实用文档PCR产物的生成量是以指数方式增加的,能将皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=10-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学中最小检出率为3个细菌。4.3简便、快速PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在DNA扩增

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