《基因工程育种》PPT课件

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1、第八章基因工程育种1第一节基因工程育种概述第二节重要的工具酶第三节常用的载体第四节基因工程育种基本过程第五节基因工程育种的应用主要内容2第一节基因工程育种概述3Cohen和Boyverl973年首次成功完成了DNA分子的体外重组实验,宣告基因工程(geneengineering)的诞生,也为微生物育种带来了一场革命。基因工程育种广义的基因工程育种包括所有利用DNA重组技术将外源基因导入到微生物细胞,使后者获得前者的某些优良性状或者利用后者作为表达场所来生产目的产物。4基因工程育种的优势与传统育种方法不同的是

2、,基因工程育种可以突破物种间的障碍,实现真正意义上的远缘杂交。而且这种远缘既可跨越微生物之间的种属障碍,还可实现动物、植物、微生物之间的杂交。同时,利用基因工程方法,人们可以“随心所欲”地进行自然演化过程中不可能发生的新的遗传组合,创造全新的物种。这是一种自觉的、能像工程一样事先进行设计和控制的育种技术,是最新、最有前途的育种方法。5第二节重要的工具酶6工具酶基因工程中的工具酶主要是指用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、修饰、反转录等有关的各种酶系统。7一、限制性核酸内切酶(RE)是一类由细菌产生的能

3、专一识别双链DNA中的特定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键的核酸内切酶,简称限制酶或切割酶。根据限制酶的作用特性,一般分为三类:——Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型,其中常用的是Ⅱ型限制酶。8限制酶(Ⅱ型)识别及切割位点特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断,主要产生3种缺口:5ˊ-粘性末端3ˊ-粘性末端平头末端回文序列是指该部位的核苷酸序列呈180O旋转对称;粘性末端是指经内切酶特异切割后产生的5ˊ-末端突出或3ˊ-末端突出的碱基序列,相互具有互补性。910其它特殊性质的Ⅱ型限制酶同裂酶(异源同工酶)同尾酶可

4、变酶11同裂酶又称异源同工酶。指来源不同,但具有相同的识别序列。在切割DNA时,其切割点可以是相同的,产生平头末端,称为同识同切;切割点也可以是不同的,产生3ˊ或5ˊ粘性末端,称为同识异切。12同裂酶——同识同切13同裂酶——同识异切14同尾酶同尾酶指来源不同,但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端。15可变酶可变酶识别顺序中的一个或几个碱基是可变的,并且识别顺序往往超过6个碱基对。如,BstpⅠ,其识别顺序为GGTNACC。16常用限制性核酸内切酶的特性微生物名称酶名称识别顺

5、序同裂酶同尾酶BacillusamyloliquefaciensH解淀粉芽孢杆菌BamHⅠGGATCCBstⅠBglⅡMboⅠBacilliusglobigil球芽孢杆菌BglⅡACATCTEscherichiacoliRY13大肠杆菌EcoRⅠGAATTCHaemophilusinfluenzae流感嗜血菌HindⅢAAGCTTHsuⅠProvidenciastuartii164普罗威登细菌PstⅠCTGCAGSalpⅠStreptomycesalbusSubspeciespathocidicus白色链球

6、菌SalⅠGTCGACAvaⅠXhoⅠ17二、DNA聚合酶(最常用的DNA聚合酶有以下4种)DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅰ大片段——Klenow片段TaqDNA聚合酶T4噬菌体DNA聚合酶18㈠DNA聚合酶ⅠE.ColiDNA聚合酶Ⅰ(DNApolⅠ)是一个具有3种酶活性的多功能性酶。包括:5ˊ→3ˊDNA聚合酶活性5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性19DNApolⅠ应用⑴催化DNA缺口平移反应,制备高比活性DNA探针;⑵第二条cDNA链的合成;⑶对DNA3ˊ突出末端进行标记;⑷DNA序列分析。

7、20E.coliDNApolⅠ催化切口平移21㈡Klenow片段(DNApol.大片断)22Klenow片段用途⑴补齐双链DNA的3ˊ末端;⑵用标记碱基补齐3ˊ末端;⑶在cDNA克隆中,用于第二股链的合成;⑷DNA序列分析。23㈢TaqDNApol(耐热DNA聚合酶)作用特点1)TaqDNApol催化DNA合成的最适温度范围7075℃,2)95℃以上高温,半小时不失活,3)最适合用于聚合酶链反应(PCR)。24三、逆转录酶特点逆转录酶是一个多功能性酶,至少具有以下3种酶活性:⑴以单链RNA为模板,催化合成

8、cDNA单链⑵具有RNaseH活性,能水解RNA:DNA杂交链中的RNA⑶以DNA为模板,催化合成cDNA双链。25逆转录酶的应用:⑴将mRNA逆转录成cDNA,构建cDNA文库;⑵补平和标记5ˊ-末端突出的DNA片段;⑶代替Klenow酶用于DNA序列分析;⑷制备杂交探针等。26四、DNA连接酶(DNAligase)DNA连接酶可以催化带有粘性末端或平头末端的双链DNA中一条链的3ˊ-OH与另一条链的5ˊ-PO

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1、第八章基因工程育种1第一节基因工程育种概述第二节重要的工具酶第三节常用的载体第四节基因工程育种基本过程第五节基因工程育种的应用主要内容2第一节基因工程育种概述3Cohen和Boyverl973年首次成功完成了DNA分子的体外重组实验,宣告基因工程(geneengineering)的诞生,也为微生物育种带来了一场革命。基因工程育种广义的基因工程育种包括所有利用DNA重组技术将外源基因导入到微生物细胞,使后者获得前者的某些优良性状或者利用后者作为表达场所来生产目的产物。4基因工程育种的优势与传统育种方法不同的是

2、,基因工程育种可以突破物种间的障碍,实现真正意义上的远缘杂交。而且这种远缘既可跨越微生物之间的种属障碍,还可实现动物、植物、微生物之间的杂交。同时,利用基因工程方法,人们可以“随心所欲”地进行自然演化过程中不可能发生的新的遗传组合,创造全新的物种。这是一种自觉的、能像工程一样事先进行设计和控制的育种技术,是最新、最有前途的育种方法。5第二节重要的工具酶6工具酶基因工程中的工具酶主要是指用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、修饰、反转录等有关的各种酶系统。7一、限制性核酸内切酶(RE)是一类由细菌产生的能

3、专一识别双链DNA中的特定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键的核酸内切酶,简称限制酶或切割酶。根据限制酶的作用特性,一般分为三类:——Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型,其中常用的是Ⅱ型限制酶。8限制酶(Ⅱ型)识别及切割位点特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断,主要产生3种缺口:5ˊ-粘性末端3ˊ-粘性末端平头末端回文序列是指该部位的核苷酸序列呈180O旋转对称;粘性末端是指经内切酶特异切割后产生的5ˊ-末端突出或3ˊ-末端突出的碱基序列,相互具有互补性。910其它特殊性质的Ⅱ型限制酶同裂酶(异源同工酶)同尾酶可

4、变酶11同裂酶又称异源同工酶。指来源不同,但具有相同的识别序列。在切割DNA时,其切割点可以是相同的,产生平头末端,称为同识同切;切割点也可以是不同的,产生3ˊ或5ˊ粘性末端,称为同识异切。12同裂酶——同识同切13同裂酶——同识异切14同尾酶同尾酶指来源不同,但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端。15可变酶可变酶识别顺序中的一个或几个碱基是可变的,并且识别顺序往往超过6个碱基对。如,BstpⅠ,其识别顺序为GGTNACC。16常用限制性核酸内切酶的特性微生物名称酶名称识别顺

5、序同裂酶同尾酶BacillusamyloliquefaciensH解淀粉芽孢杆菌BamHⅠGGATCCBstⅠBglⅡMboⅠBacilliusglobigil球芽孢杆菌BglⅡACATCTEscherichiacoliRY13大肠杆菌EcoRⅠGAATTCHaemophilusinfluenzae流感嗜血菌HindⅢAAGCTTHsuⅠProvidenciastuartii164普罗威登细菌PstⅠCTGCAGSalpⅠStreptomycesalbusSubspeciespathocidicus白色链球

6、菌SalⅠGTCGACAvaⅠXhoⅠ17二、DNA聚合酶(最常用的DNA聚合酶有以下4种)DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅰ大片段——Klenow片段TaqDNA聚合酶T4噬菌体DNA聚合酶18㈠DNA聚合酶ⅠE.ColiDNA聚合酶Ⅰ(DNApolⅠ)是一个具有3种酶活性的多功能性酶。包括:5ˊ→3ˊDNA聚合酶活性5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性19DNApolⅠ应用⑴催化DNA缺口平移反应,制备高比活性DNA探针;⑵第二条cDNA链的合成;⑶对DNA3ˊ突出末端进行标记;⑷DNA序列分析。

7、20E.coliDNApolⅠ催化切口平移21㈡Klenow片段(DNApol.大片断)22Klenow片段用途⑴补齐双链DNA的3ˊ末端;⑵用标记碱基补齐3ˊ末端;⑶在cDNA克隆中,用于第二股链的合成;⑷DNA序列分析。23㈢TaqDNApol(耐热DNA聚合酶)作用特点1)TaqDNApol催化DNA合成的最适温度范围7075℃,2)95℃以上高温,半小时不失活,3)最适合用于聚合酶链反应(PCR)。24三、逆转录酶特点逆转录酶是一个多功能性酶,至少具有以下3种酶活性:⑴以单链RNA为模板,催化合成

8、cDNA单链⑵具有RNaseH活性,能水解RNA:DNA杂交链中的RNA⑶以DNA为模板,催化合成cDNA双链。25逆转录酶的应用:⑴将mRNA逆转录成cDNA,构建cDNA文库;⑵补平和标记5ˊ-末端突出的DNA片段;⑶代替Klenow酶用于DNA序列分析;⑷制备杂交探针等。26四、DNA连接酶(DNAligase)DNA连接酶可以催化带有粘性末端或平头末端的双链DNA中一条链的3ˊ-OH与另一条链的5ˊ-PO

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