《分子生物学与临床》PPT课件

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1、分子生物学与临床天津市第三中心医院刘树业随着分子生物学技术的发展，聚合酶链反应（PCR）技术已逐渐应用于遗传性疾病、肿瘤及感染性疾病等方面的诊断。1.检测临床标本中病原体核酸序列。2.肿瘤基因突变情况。3.遗传性疾病的基因序列。4.人类白细胞表面抗原（HLA）配型。5.法医学方面的鉴定工作。PCR技术在临床实验室应用的价值优点：1.灵敏度高，理论上，只要标本中含有一个分子的DNA或RNA就可以作出诊断。2.特异性强，对于一个19核苷酸的引物来说，非特异性配对的概率为419=2.75*1011这表示要与这19个碱基的排列顺序

2、完全相同时需要的基因组DNA片段的最小长度，而人的基因组长度为3*109碱基对，以克服血清学诊断有交叉反应的缺陷。3.可以早期诊断，如在HCV的感染中，第一周内就可以检测出HCVRNA，而抗体的产生一般在第二周以后。PCR在诊断病原体感染时的优缺点4.对于体液免疫力低下或使用免疫抑制剂而无抗体产生者，PCR却可以作出明确诊断。5.可以对病原体作定量分析，反映病原体在机体的复制及动力学变化情况。6.可对病原体进行基因分型。指导临床治疗。不足之处:1.操作复杂，技术不易被熟练掌握。2.价格昂贵。3.出于敏感性太高，操作步骤多而

3、复杂，即使有极少量的污染也会造成假阳性。4.由于操作复杂，对试剂及实验条件要求严格，稍有差错就会出现假阴性。几点认识一.今后仪器和试剂的发展方向：封管、定量及自动化；二.样品采集方式对PCR很重要，比操作更重要。三.内标作用：操作过程的监控、控制假阴性。四.从核酸提取、扩增到检测，对照与待测标本同步进行；五.禁用产物的电泳分析技术。六.探针杂交技术和防污染技术的采用是一大进步。一.标本的采集常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。采血液等样本时，应使用一次性密

4、闭容器，如真空采血管。当使用非密闭采样系统时，如尿、分泌物和骨髓的采样，必须注意防止来自采样者皮屑或分泌物的污染。采样时必须戴一次性手套。玻璃器皿在使用前应高压处理，因为玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是热灭菌，250℃烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓标本必须进行抗凝处理。EDTA和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因为肝素是Taq酶的强抑制剂，而且在其后的核酸提取步骤中很难去除。临床用于RNA（如HCVRNA）扩增检测的血标本建议进行抗凝处理，并尽快（3小时以内）分离血浆，以避免RNA的降解

5、。如未作抗凝处理，则抽血后，必须在1小时内分离血清。二.标本的稳定化处理用于DNA扩增检测的标本，采集后一般不需特殊的稳定化处理，但标本应及时送至实验室。由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA测定的标本有时必须进行稳定化处理，如流行病学调查的现场采样。异硫氰酸胍盐（Guanidinethiocyanate,GITC）可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按1∶4的比例加至含有5mol/LGITC的试管内中，从而使血清（浆）中的RNA酶不可逆失活。经上述稳定化处理后，标本一般不需要冷

6、藏即可邮寄。对于特定的检测项目，上述稳定化处理方法的效果究竟如何，要使用相应的逆转录PCR测定方法来评价。三.标本的运送标本采集后必须尽快送至实验室。经过适当稳定化处理的标本可在常温下通过邮寄运送。如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血标本及用于RNA扩增检测的经GITC稳定化处理的标本，通常在运送时，应采用不易破碎的容器装载标本。用于RNA检测的标本，如果未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。四.标本的贮存临床体液标本如血清/血浆等可于-70℃下长时间贮存。用于DNA测定的已纯化核酸样本可在10mmol/LTri

7、s-1mmol/LEDTA缓冲液（pH7.5-8.0）中4℃保存，用于RNA测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80℃或液氮中贮存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20℃即可。用GITC处理的RNA标本在室温可保存7天。五.标本的处理（核酸提取）标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性步骤，在使用商品核酸提取试剂提取临床标本中的核酸模板前，应对其进行充分评价以验证其提取的有效性。通常，核酸制备质量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能来源于标本本身（如血红素及其前体或降解产物）或核酸提取过程中残留的有机溶剂（如酚、氯

8、仿等），这些物质对其后的Taq酶扩增反应步骤具有强烈的抑制作用，从而影响靶核酸的扩增测定。当标本为痰时，则必须先进行液化处理，再提取核酸。需注意的是，液化时不能加热，液化时间不能过长。此外，当靶核酸为RNA时，逆转录PCR测定失败的常见原因是标本在运送前未经充分的稳定化处理(血清或血浆按1∶4的比例加至