发酵工程在现代生物技术中的应用

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1、发酵工程在现代生物技术中的应用生物技术：应用自然学和工程学的原理，依靠生物作用剂的作用将生物物料进行加工以提供产品和为社会服务的技术。20世纪70年代以后，以DNA重组技术的建立为标志，形成了一个以基因工程为主导，发酵工程为中心，包括细胞工程和酶工程的现代生物技术体系。第一节基因工程菌发酵一、基因工程技术通过对核酸分子的插入、拼接和重组而实现遗传物质的重新组合，借助载体将重组的目的基因转移新的宿主细胞体系，并使目的基因在新的宿主体系细胞中进行复制扩增和表达所需的目的产物。基因工程菌的制备一、目

2、的基因的制备1.鸟枪法选用合适的内切酶，在Mg2+的激活下，切开供体DNA链获得目的基因，根据酶切末端特点分为a、b两类。基因工程菌的制备2.cDNA法又称反转录法，从细胞内提取目的基因的mRNA，在反转录酶的作用下，以mRNA反转录互补的cDNA。3.人工合成在电脑控制下通过合成仪合成获得的DNA片段。二、载体的准备目前常用的基因克隆载体：1.质粒：严密性质粒和松弛型质粒2.pBR322和pUC：去除原有质粒的非必须功能，引入选择标记和在适宜的位置设置限制酶单一切点。3.噬菌体载体有λ噬菌体和

3、M13噬菌体三、基因与载体的连接外源DNA与载体DNA之间连接方式：1.粘性末端连接先用一种酶切割外源DNA并将拟插入的那个片段用凝胶电泳分离出来，再用同一种酶去切载体DNA，这样可以通过粘性末端连接起来。2.平末端连接3.在DNA片段末端加上均聚寡核苷酸后连接：末端核苷酸转移酶能催化DNA末端的3´-OH上添加单核苷酸的反应，形成寡聚核苷酸连，如果在一个DNA片段的3´-OH末端上添加寡聚T，那么另一DNA片段的3´-OH末端上一定添加与T互补的寡聚A。四、目的基因导入受体细胞取决于是否用合适

4、的受体细胞、合适的克隆载体和合适的基因转移方法2、干热灭菌法进行干热灭菌时，微生物细胞发生氧化，微生物体内蛋白质变性和电解质浓缩引起中毒等作用，其中氧化作用导致微生物死亡是主要依据。由于微生物对干热的耐受力比对湿热强得多，故干热灭菌所需的温度要高，时间要长，一般160～170℃，1～1.5h。实际应用时，对一些要求保持干燥的实验器具和材料可以采用干热灭菌法。湿热灭菌法利用饱和蒸汽进行灭菌的方法称为湿热灭菌法。其原理是借助于蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键

5、受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。由于蒸汽有很强的穿透能力，湿热灭菌对耐热芽孢杆菌来说，温度升高10℃时，灭菌速度常数可增加8～10倍，对营养细胞更高。蒸汽来源方便，价格低廉，灭菌效果可靠，是目前最为常用的灭菌方法。一般的湿热灭菌条件为121℃，30min。湿热灭菌法煮沸灭菌法将要消毒的物品放入水中煮沸（100℃）15～20min，一般微生物的营养细胞都可以杀死，但不能杀死芽孢。巴氏消毒法法国微生物学家、化学家巴斯德首创的低温消毒法。加热到62℃，经过30分钟，以杀死不耐高温的物质中的微

6、生物和病原体的消毒法。牛奶、啤酒、黄酒、酱油和醋等用此法消毒。湿热灭菌法间歇灭菌法反复几次的常压蒸汽灭菌，以达到杀死微生物营养体和芽孢的目的。操作步骤：100℃，30-60min；37℃，1h；同上重复三次…适用于不宜高压灭菌的物质，如糖类明胶牛奶培养基。方法简单，但却麻烦；工作周期长。湿热灭菌法高压蒸汽灭菌法使用密闭的高压蒸汽灭菌锅，使灭菌锅内蒸汽不外溢，增加压力，由于压力的增高，温度也随之增高，从而提高杀菌力，缩短灭菌时间。最有效而广泛应用的灭菌方法实验室常用的是0.1MPa，121℃，15

7、～30min应用范围培养基，水，发酵罐等其他不适合干热灭菌的物品。高压蒸汽灭菌法的注意事项：完全排除锅内冷空气灭菌完毕后要缓慢减压压力降为零后打开盖子二、辐射灭菌法利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀死微生物以紫外线最常用。紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用，但细菌芽孢和霉菌孢子对紫外线的抵抗力强。紫外线的穿透力低，仅适用于表面灭菌和无菌室、培养间等空间的灭菌，且距照射物不超过1.2m；对固体物料灭菌不彻底，也不能用于液体物料的灭菌。三、化学药品灭菌法某些化学药品与微生物发生反应（蛋白变性、酶失活、

8、细胞通透性）而具有杀菌的作用。化学药剂适于生产车间环境的灭菌，接种操作前小型器具的灭菌等，不适用于培养基。化学药品的灭菌使用方法，根据灭菌对象的不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。⑴高锰酸钾高锰酸钾溶液的灭菌作用是使蛋白质、氨基酸氧化，使微生物死亡，一般用0.1％～0.25％的溶液。⑵漂白粉漂白粉的化学名称是次氯酸盐(次氯酸钠，NaOCl)，它是强氧化剂，也是廉价易得的灭菌剂。它的杀菌作用是次氯酸钠分解为次亚氯酸，后者不稳定，在水溶液中分解为新生态氧和氯，使细菌受强烈氧化作用而导致死亡，对