实验八凯氏定氮法

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1、实验八凯氏定氮法测定样品中粗蛋白的含量一、实验目的1.掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和方法。2.学会使用凯氏定氮仪。二、实验原理1.消化：有机物中的胺根在强热和CuSO4/K2SO4，浓H2SO4作用下，消化生成（NH4）2SO4；2NH3+H2S04+2H+(NH4)2S042.蒸馏：在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中；(NH4)2SO4+2NaOH2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3(NH4)2B4O7+5H2O3.滴定:用已知浓度的HCI标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的

2、换算因子，既得蛋白质的含量。(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3二、实验原理1、豆浆粉2、浓硫酸3、混合催化剂：CuSO4/K2SO4=0.4/64、混合指示剂：0.1%甲基红乙醇溶液200ml与0.1%甲烯蓝乙醇溶液50ml混合5、NaOH:40%6、2%硼酸溶液7、0.01N标准盐酸溶液三、实验器材四、实验步骤（一）消化精密称取豆浆粉1.0g，移入干燥消化管中，加入混合催化剂6.4g，摇匀后再加入15ml浓硫酸和两颗玻璃珠，放入消化炉中消化。起始电压150V，消化1h后，观察消化管内泡沫变化，泡沫消失后，加强火力到220V

3、，继续消化，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。取下消化管放冷，小心加蒸馏水至50ml，混匀备用。取与处理样品相同量的混合催化剂按同一方法做试剂空白试验。（二）蒸馏（1）装好蒸馏装置，如图：四、实验步骤（2）洗涤蒸馏装置①在蒸气发生烧瓶中加约70颗玻璃珠，2/3体积的蒸馏水，加入4~5滴浓硫酸及4~5滴混合指示剂。②沿小漏斗加入蒸馏水约20mL到反应室，留半漏斗水，保持水封，防止漏气。③加热产生蒸气后，立即关闭废液排放管上的开关，蒸气进入反应室，导致反应室内的水迅速沸腾，蒸出蒸气由反应室上端口通过定氮球进入冷凝管冷却，在冷凝管下端放置一个锥形瓶接收冷

4、凝水。四、实验步骤④从定氮球发烫开始计时，连续蒸煮5min，停止加热。⑤冲洗完毕，夹紧蒸气发生器与收集器之间的连接硅胶管，由于气体冷却压力降低，反应室内废液自动抽到蒸汽收集器中，打开废液排出口夹子放出废液。四、实验步骤（3）蒸馏样品①向接收瓶内加入20ml2%硼酸溶液及混合指示液2滴，并使冷凝管的下端插入液面下②吸取10.0ml样品消化稀释液由小漏斗流入反应室，并以5ml水洗涤小烧杯使流入反应室内。③将10ml40%氢氧化钠溶液经小漏斗缓缓流入反应室，立即加半漏斗水水封以防漏气，开始蒸馏。④蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，从指示剂开始变色时计时，蒸

5、馏5min。⑤移动接受瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min。四、实验步骤（三）滴定用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N盐酸标准溶液滴定至淡紫红色为滴定终点。(四)洗涤凯氏定氮仪（按照上述方法）四、实验步骤五、实验结果样品的总氮含量(%)=(A—B)×0.1×14×5/1000×C若测定的样品含氮部分只是蛋白质(如血清)，则：样品中的蛋白质含量(%)=(A－B)×0.1×14×6.25×5/1000×CA－滴定样品用去的盐酸体积(ml)；B－滴定空白用去的盐酸体积(ml)；C－称量样品的量(g)；0.1－盐酸的摩尔浓度(mol/L)；14

6、－氮原子量；6.25－系数