X3-1-2基因工程的基本操作程序

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1、11.2基因工程的基本操作程序专题1基因工程23基因工程的基本操作程序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定4编码区非编码区非编码区编码区上游编码区下游终止子启动子与RNA聚合酶结合位点补：原核细胞的基因结构编码区：非编码区：编码蛋白质，连续不间断不编码蛋白质，有调控作用5编码区非编码区非编码区编码区上游编码区下游终止子启动子与RNA聚酶结合位点补：真核细胞的基因结构外显子内含子不编码蛋白质，有调控作用编码区：非编码区：外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列6结构基因外显子内含子转录、加工修饰成熟mRNA7关于内含子

2、和外显子的说法正确的是（）A.内含子和外显子在转录的过程中都能够转录成成熟的mRNAB.只有外显子能够转录成mRNA，tRNA，rRNAC.原核细胞基因中也有内含子和外显子D.由于内含子不能编码蛋白质，故它属于非编码区B8从基因文库中提取目的基因1基因文库(genelibrary)概念又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。9基因文库的分类按照外源DNA片段的来源：从

3、特定组织提取的染色体基因组DNA--基因组DNA文库（总）mRNA反转录成的cDNA拷贝--cDNA文库（部分）基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。10基因组文库部分基因文库11基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因12利用PCR提取目的基因PCR：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。原理：DNA双链复制原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子13模板DNA（已知碱基序列）特异性引物（DNA）耐热DNA聚合酶（Taq酶）dNTPs（4种脱氧核苷酸）Mg+(促进

4、dNTP与核酸骨架作用)PCR体系基本组成成分14PCR的基本反应步骤变性90-95˚C延伸70-75˚C退火55-60˚C第三步：将反应体系升温至70～75℃，在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3-OH上，使DNA链延伸合成，产生一条与模板链互补的DNA链。第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至90～95℃，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板。第二步：将反应体系降温至55～60℃，使两种引物分别与模板DNA链配

5、对结合，这个过程称为复性。15模板DNA95℃5’3’3’5’5’3’3’5’变性1655℃5’3’3’5’5’5’AB引物AB退火1772℃5’3’3’5’5’5’Taq酶延伸11872℃5’3’3’5’5’5’延伸219TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)405060708090100100806040202072℃94℃55℃PCR循环21模板DNA95℃22PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物23PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃T

6、aq酶Taq酶24PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第1轮结束第2轮开始25PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq26PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束27PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数28靶序列靶序列PCR循环第一步：加热变性29靶序列

7、靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环第二步：引物与靶序列退火30靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循环第三步：引物延伸31靶序列靶序列第1个PCR循环完成后：得到两个拷贝的靶序列32PCR是针对特定DNA片断的快速体外复制增殖技术每循环一轮，目的基因的量可增加一倍增殖速率为2n,（n为循环次数）每完成一个循环需2-4分钟，2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。33PCR技术扩增过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，断裂，形成。b、复性（55℃-60