基因工程的基本操作程序新

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1、1．2基因工程的基本操作程序【问题导引】基因工程的基本操作程序包括哪几个步骤？基因工程的核心步骤是什么？获取目的基因的方法有哪些？基因表达载体组成及作用？目的基因检测与鉴定有几种方法？【疑难点拔】1、【问题导引】为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？cDNA文库、基因组文库的区别？反转录法、人工合成目的基因的过程？利用反转录法得到的目的基因有何特点？PCR含义、原理、过程？DNA复制、PCR技术与基因克隆有何区别？1.第一步：目的基因的获取(1)目的基因的获取方法：①从供体细胞直接获取；②从基因文库中获取；③利用mRNA反转录形成；④利用PCR扩增技术；⑤人工合

2、成。(2)基因文库、基因组文库、cDNA文库的概念及目的①基因文库含义：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入的群体中通过克隆而储存，含有这种生物的基因的群体便构成了基因文库。②分类：基因文库包括基因组文库和cDNA文库。①含有一种生物的基因的基因文库就叫做基因组文库。②含有一种生物的基因的基因文库就叫做部分基因文库，如文库。一般由mRNA转录而来。③建立基因文库的目的：为保存或获得大量的目的基因作准备，有了基因文库，就可随时从中提取所需要的目的基因，引入受体细胞使之表达。注意基因文库不是直接保管相应基因，而是保存受体菌(受体菌中含基因)受体菌在培养基上以菌落形式存在，每一个菌落

3、都由一个细胞繁殖而来，携带着同种基因，可以利用目的基因的有关信息，找到目的基因所在菌落，然后再进行提取。可以据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。基因组文库的比较cDNA文库8文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中内含子基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种之间的基因交流部分基因可以说明基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便,缺点是工作量大,具有一定的盲目性注：原核生物的基因结构与真核生物基因结构（3）人工合成法：如果基因片

4、段比较，核苷酸序列又已知，也可以利用DNA合成仪用化学方法直接人工合成。（4）)扩增目的基因——PCR①概念：PCR是一项在复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过这一技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。②原理：PCR是利用的原理，条件：已知目的基因的序列。方式：指数扩增=(n为扩增循环的次数)③过程：目的基因DNA受热变性后解旋形成单链，与单链相应互补序列结合，然后在作用下进行延伸，如此重复循环多次。1.5DNA复制、PCR技术与基因克隆项目DNA复制PCR扩增技术场所真核生物：细胞核、叶绿体、线粒体原核生物：细胞质生物体外(PCR扩增仪)条件模板、ATP、四种脱氧核苷酸、引物链（R

5、NA）、常温模板、四种脱氧核苷酸、引物链（DNA或RNA片段）、温度变化（90～95℃→55～60℃→70～75℃）解旋在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开加热至90℃左右，双链全部解开，不需解旋酶酶DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）合成子链在引物的基础上，一条链连续(前导链)，另一条链不连续（滞后链），先合成片段，再由DNA连接酶连接分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72℃特点边解旋边复制，形成的是整个DNA分子，一个细胞周期只复制一次体外迅速扩增，短时间内形成大量目的基因DNA片段，呈指数增长（2n）相同点①需提供DNA复制的模板②四

6、种脱氧核苷酸作原料③子链延伸的方向都是从5′端到3′端基因克隆：用多种限制性核酸内切酶或机械方法，将某种生物细胞中的DNA切成不同片段，并把所有片段随机地分别连接到用同种内切酶切过的基因运载体上，然后分别转移到适当受体细胞，如细菌中。通过细菌增殖而构成各个片段的无性繁殖系。【问题导引】为什么不把目的基因直接导入受体细胞，而是要构建表达载体？基因表达载体的组成包括哪些？各起什么作用？目的基因与质粒结合形成重组质粒的步骤是怎样的？2.第二步：基因表达载体的构建——基因工程的核心8（1）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。（2）组成：目的

7、基因＋＋＋标记基因+复制原点，插入的目的基因的表达需要调控序列，因而用作载体的质粒的插入基因部位的上游需有，下游需有。如图：①启动子：一段有特殊结构的片段，位于基因的首端。它是聚合酶识别、结合的部位。②终止子：一段有特殊结构的短片段，位于基因的尾端。作用是使过程停止。③启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA);终止子(DNA片段)≠终止密码子(RNA)④标记基因：一般为抗生素抗性基因或荧光基因等，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因(目的基