利用酵母菌生产蛋白质

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1、第5章利用酵母菌生产蛋白质概述酵母菌的基因组结构及其特点酵母表达系统影响酵母菌中外源基因表达的调控因子外源基因的表达及产物分泌酵母细胞模式图1、概述核膜（双层膜）真核：DNA＋组蛋白＋RNA核仁细菌细胞无核膜、核仁原核：DNA裸露细胞器与膜系统差别很大外源蛋白表达系统原核表达系统-高水平表达为还原性内环境，不能形成二硫键，某些蛋白不能进行有效折叠1外源蛋白表达系统原核表达系统-高水平表达为还原性内环境，不能形成二硫键，某些蛋白不能进行有效折叠1真核表达系统相对高水平表达可发生一定程度的翻译后修饰作用，有利于实现完整蛋白功能2外源蛋白表达系统原核表达系统-高水平表达为还原性内环境，不能形

2、成二硫键，某些蛋白不能进行有效折叠1真核表达系统相对高水平表达可发生一定程度的翻译后修饰作用，有利于实现完整蛋白功能2哺乳细胞系统-完备的翻译后修饰系统-低表达水平3蛋白质表达系统的选择细菌哺乳动物细胞昆虫细胞酵母菌增加人培养细胞品质细菌酵母菌昆虫细胞哺乳动物细胞产量蛋白质产品原核表达系统与真核表达系统的比较：（1）区域化原核生物：细胞质真核生物：内质网：大部分蛋白内质网-高尔基体：分泌性蛋白①氧化还原电位低－氧化型环境；②二硫化物异构酶；③辅助蛋白（折叠酶；分子伴侣chaperonine）在细菌中合成生产的真核生物蛋白由于缺乏翻译后加工过程，往往导致失去生物活性

3、。真核生物翻译后修饰作用：①形成正确的二硫键。由二硫键异构酶催化完成。蛋白质折叠所必需，否则不能正确折叠的蛋白质不稳定，且失去生物学活性。血红蛋白3级结构4级结构（2）翻译后修饰作用一级结构二级结构三级结构四级结构α－螺旋β－折叠高级结构②切割前体。前体蛋白中的某些氨基酸序列如信号肽的切出，形成有功能的蛋白质。③蛋白质的糖基化。是将寡糖连接到一个蛋白质分子上，是真核生物细胞表达基因产物时最重要的一种翻译后修饰作用。作用：i.有利于保证所表达的蛋白质进行适当的折叠；ii.保护蛋白质免受细胞蛋白酶的降解。最常见的是O-糖基化（加在Ser,Thr上）和N-糖基化（加在Asn上）。酵母菌中的寡

4、糖通常含有大量的甘露糖残基。多糖和蛋白质在细胞壁上的连接方式2.O-glycosidiclinkage1.N-glycosidiclinkage一般酵母菌中的寡糖12酵母菌突变株mnn9中的寡糖在酵母菌中的糖基化只能添加富含甘露糖的寡糖，而不形成象高等动物细胞中普遍存在的那种糖蛋白复合物。这种糖基化有时会影响蛋白质的折叠和对蛋白酶的敏感性，更重要的是会影响蛋白质在生物体内的半衰期。④对氨基酸的修饰作用。包括磷酸化、甲基化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、羧酸化、豆蔻酸化及软脂酰化等。在原核生物中，可分泌蛋白质是由N末端信号序列控制合成的，然后通过细胞膜上的“SecY-SecD-SecE-S

5、ecF”组成的蛋白质复合物分泌出去。（3）真核细胞与原核细胞的蛋白质分泌途径在酵母菌中，分泌蛋白的信号序列为信号识别颗粒（SRF）所识别。SRF包含6种蛋白质分子，并由一个小的RNA分子将其串连在一起。通过SRF与其在膜表面上的受体之间的识别与结合，引导新生蛋白到达蛋白质的输出结构，该结构位于粗糙内质网的特异性位点上。在原核生物中LPS的产生。LPS的毒性；酵母菌：细胞组分和代谢物对人体是安全的。（4）安全性选择性标记基因启动子转录、翻译终止信号给mRNA加上poly(A)复制起始位点酵母菌表达系统2、酿酒酵母基因组结构及其特点1996年完成全长为12Mb酿酒酵母基因组的测序。酿酒酵母

6、是一种重要的模式生物，也是第一个被测序的真核生物。它有16条染色体，基因组全长为12Mb，含有6000多个基因。它的基因组的测序是作为HGP的一部分于上世纪80年代末期启动，于1996年完成。1997年《Nature》专门为酿酒酵母基因组发行了增刊。酿酒酵母的基因组很小，仅有16条染色体。酿酒酵母细胞既可以作为单倍体存在，也可以作为二倍体存在－有利于发现隐性基因。12068kb5109bp3.5109bp1.8108bp4106bp基因组全长12068kb，有5885个编码专一性蛋白质的开放阅读框。酵母基因组中平均每隔2kb就存在一个编码蛋白质的基因，即整个基因组有72％的核苷

7、酸顺序由开放阅读框组成。酵母基因组的基因间隔区较短，基因中内含子稀少。其开放阅读框平均长度为1450bp即483个密码子，最长的是位于XII号染色体上的一个功能未知的开放阅读框(4910个密码子)，还有极少数的开放阅读框长度超过1500个密码子。酵母基因组中还包含：约140个编码RNA的基因，排列在XII号染色体的长末端；40个编码snRNA的基因，散布于16条染色体；属于43个家族的275个tRNA基因也广泛分布于基因组中。2.1酿酒酵母基因