分类资料的统计描述与简单推断及SAS过程

《分类资料的统计描述与简单推断及SAS过程》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、Westernblot技术定义：印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法WesternBlot基本原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝

2、胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。WesternBlot一般流程蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色曝光、显影、定影细胞裂解液50mmol/LTris.Cl(PH=8.0)150mmol/LNaCl0.02%叠氮钠0.1%SDS100ug/mlPMSF(苯甲基磺酰胺)1ug/mlAprotinin(抑蛋白酶肽)1%NP-400.5%去氧胆酸钠蛋白的提取用预冷的PBS漂洗细胞两次，弃洗液并吸尽残余液体。加入细胞裂解液，用细胞刮刀刮下细胞，由于染色体DNA的释放，溶液变得很粘稠，将裂解产物吸入1.5ml离

3、心管。整个过程必须在冰上进行,防止蛋白降解。超声剪切染色体DNA,直至溶液不再粘稠为止。超声的频率，时间，次数，不能起泡沫，探头应插入液面以下。4度离心机离心，10000rpm，10分钟(或12000rpm,2分钟)。分三层：上层为油脂，中层为蛋白质，下层为沉淀。将上清移入另一Eppendorf管，存于-80°C冰箱保存。加入蛋白上样缓冲液并置于沸水浴中加热3-5分钟，变性待用。蛋白质定量/浓度测定A280光吸收法Bradford检测法Lowry检测法BCA(二喹啉甲酸)检测法斑点滤膜结合法DCProteinAssay注意：上样的准确；该避光的避光；标准曲

4、线的制作；样品的稀释，需落在标准曲线上。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：SDS是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当SDS与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和SDS的平均结合量是1:1.4(以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之SDS後,由於SDS带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致(chargedensity),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。凝胶成份丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺

5、避光，保存时间SDSTris-Cl缓冲液TEMED避光过硫酸铵保存时间去离子水操作图示配胶注意事项western常用胶为不连续、变性SDS-聚丙烯酰胺胶，上层为浓缩胶，下层为分离胶。配制分离胶用水封液面时，注意加水需轻柔,沿玻璃缓缓流下,而不能砸下,保持分界处的平直,以及交接面不会被水所稀释,影响蛋白分离效果及条带的美观性(也可以用异丁醇)。引发剂及增速剂用量需适当，胶凝聚的时间控制在30min到1h为宜。在已聚合的分离胶上灌注浓缩胶，立即插入干净梳子，小心避免混入气泡。凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（％）线性分离范围（KD)1512-431016-687

6、.536-945.057-212蛋白markerNEB蛋白markerBio-rad彩虹marker胶的染色考马斯亮蓝染色银染最小检出量为0.1ug最小检出量为0.1-1ng转膜MiniTrans-Blotcellcomponents聚丙烯酰胺胶-膜三明治半干转快速，约10-30min湿转较稳定，250mA，1.5-2h膜的染色丽春红染色可逆，灵敏度较低，且红色不易拍照氨基黑染色不可逆，灵敏度为30ng/条带印度墨汁染色不可逆，灵敏度为6ng/条带胶体金染色灵敏度最高，400pg/条带封闭液脱脂奶粉（5％）BSA（3%）WesternBlot膜封闭液（生物

7、试剂公司提供）封闭注意事项封闭的作用是封闭膜上非特异性位点，防止抗体非特异性地结合在膜上。可4度过夜或在常温1h。尼龙膜及PVDF膜可适当延长封闭时间。奶粉封闭液最为物廉价美，但若牛奶中可能含有需western的蛋白时，则不能用其作为封闭液。也可用3%明胶封闭。一抗、二抗孵育将膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37℃2-4小时或4℃过夜。用TST洗液洗膜3次，每次10min。加入用TST配制的二抗，摇床上缓慢摇动，常温1小时。用TST洗液洗膜3次，每次10min。抗体的结合常用抗体品牌：CellSi

8、gnaling，R&D，Chemicon，Rockland，BD，