分子荧光分析法1

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1、一、荧光分析的基本原理二、荧光分析仪三、分子荧光分析法及其应用第三章分子荧光分析法molecularfluorescenceanalysis2021/8/61575：西班牙植物学家N.Monardes观察到荧光现象1852：Stokes研究荧光，提出作为一种分析手段1867：Goppelsroder首次应用方法1880：提出荧与化学结构关系的经验法则1928：Jette和West第一台光电荧光计1952：第一台商品化的荧光分光光度计特点：1)灵敏度高（1-100ppb)：有的可达0.01ppb；2)选择性强；3)方法简单快速，用样量少;4

2、)提供比较多的物理参数。3.1荧光分析的基本原理2021/8/63.1荧光分析的基本原理分子发光：处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。荧光和磷光:当紫外光照射某些物质时，由于这些物质结构的特殊性，会发出比吸收波长更长的不同波长的可见光，当紫外光照射停止时,随之消失的光叫做荧光，不立即消失的光叫磷光。2021/8/63.1荧光分析的基本原理分子能级=电子能级(Ee)+振动能级(Ev)+转动能级(Er)。电子激发的多重度：M=2s+1Pauli不相容原理：分子

3、中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。单重态:如果分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的,s=0,M=1三重态：电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，s=1,M=3S0S1S2T1T23.1.1分子发光的产生2021/8/6去活化发射光子非辐射跃迁化学反应荧光磷光振动驰豫系间跨越内转换外转换激发光去除后，荧光立即消失激发光去除后，磷光不会立即消失熄灭或猝灭3.1荧光分析的基本原理3.1.1分子发光的产生2021/8/63.1.2激发光谱和发射光谱激发光谱:固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照

4、射光波长的关系曲线（图中曲线I）激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者完全相同！发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？吸收池光源检测器单色器信号显示系统单色器2021/8/6荧光激发光谱与发射光谱的特征a.Stokes位移在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此，在激发和发射

5、之间产生了能量损失。b.发射光谱的形状与激发波长无关分子被激发到高于S1的电子态的更高振动能级，然而由于内转换和振动弛豫的速率很快，很快损失多余的能量而衰变到S1电子态的最低振动能级尽管分子受激到达不同能级的激发态，不管激发波长如何，电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层，而与荧光体被激发至哪一个电子态无关。无论激发波长是λ1还是λ2，荧光的波长都是λ΄23.1.2激发光谱和发射光谱激发光谱的形状与发射波长也无关2021/8/6ex=290nm(MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm(MAX)

6、em=620nm(MAX)S04321S143211→41→31→21→11→41→41→21→1c.镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的各振动能级之间的跃迁和反跃迁几率相等2021/8/6200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱2021/8/63.1.3荧光与分子结构的关系分子荧光产生的必备条件分子必须能够吸收激发光分子必须具有一定的荧光量子产率影响因素：荧光

7、产生过程中，辐射和无辐射过程；与每一过程的速率常数有关；kf分子结构决定（内因）；主要取决于化学结构和化学环境和结构共同决定。2021/8/6n振动弛豫激发n荧光（1）跃迁类型：具有电子跃迁类型的结构跃迁是产生荧光的主要跃迁类型较大的摩尔吸光系数较短的激发态寿命10-7~10-9s串越至三重态几率小2021/8/6（2）具有大的共轭π键结构共轭度越大，荧光越强。原因：共轭体系越大，离域大π键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。化合物苯萘蒽丁省戊省λexmax(nm)205286365390580

8、λemmax(nm)278321400480640F0.110.290.460.600.522021/8/6（3）具在刚性平面结构0.9210.182021/8/