铁对四尾栅藻生长的影响

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万方数据刘静等铁对四尾栅藻生长的影响铁对四尾栅藻生长的影响静盛海君徐轶群封克8(扬州大学环境科学与工程学院,江苏扬州225009)摘要采用实验室模拟培养的方法,分别测定了初始Fe3+摩尔浓度为o、10、100、looo、10ooo、30000nmol/L时的四尾栅藻生物量、叶绿素a浓度,同时利用扫描电镜观察了初始Fe3+摩尔浓度为o、10ooo、30ooonmol/L时的四尾栅藻细胞的表面结构。结果表明,初始Fe”摩尔浓度在O、10nm01/L时,四尾栅藻的生长受到抑制;初始Fe3+摩尔浓度超过10ooonmol/L时,四尾栅藻生长受到的促进作用仍存在,但不显著l初始Fe”摩尔浓度增加至30000nmol/L时,四尾栅藻生长未受到抑制;四尾栅藻叶绿素a浓度随时同的变化与四尾栅藻生长曲线相似,随初始蹭+浓度的增加而增加;不同初始Fe3+浓度对四尾栅藻细胞表面结构影响不明显。关键词四尾栅藻Fe3+叶绿索a细胞表面结构EffectofFe∞伽e智mw协of&e一口dPsm“s口蛐d—c口耐4L玩.,i”g,勒P,lgH口巧“",X比Ⅵg“挖,凡7lgKP.(cozzP驴。厂Ek讲rD卵,雄F行t口fSfiP,zce4咒dE竹gi竹PBri以g,Ya,192.Ilo“Lkit肥,百ify,Ya,zgz^DH.,i口以95越225009)Abstr扯t:SfP竹PdPsm群s口凇d一∞“dnisacommonwinterandspringgreenalgaeofTaihuLake,anditoftenpre—dominatesinwaterwithahighC02concentrationand/oralowpH.TheeffectofFeonthegrowthofSfP砣PdPs,咒“sq16口dricnt‘dnwasinvestigatedinthisstudy.Seriesof250mLflaskscontainingthepreparedSc已行edPs优“sq“ndricn越一d口culturewereincubatedat(25士1)℃foronemonthunder6Fe3+concentrations(O,10,100,1OOO,10OOO,30000nmol/L).ThefinaIquantityandchlorophyllacontentofthealgaeweremeasured,andSEMphotomicrographsofthealgaeweretakenforobservationofthesurfacestructure.ThepresenceofFeenhancedthegrowthofScP,zPdPs优群sg”口dric4“d口;thegrowthrateincreasedwiththeFe3+concentrationupto10OOOnmol/LandthatnoinhibitionwasfoundatahighFe3+concentrationof30OOOnmol/L.ThesurfacesofalgaewerenotsignificantlyaffectedbytheamountofFepresentinthegrowthmedium.Keywords:Sce,ledes,挖“5口l‘ndric口l‘d口;Fe3+;chlorophyl}a;superficialstructure太湖是我国五大淡水湖泊之一,近年随着工业的发展、人类活动的增强、污染的加剧,湖泊富营养化越来越严重,藻类优势种也发生着变化,由20世纪60年代的硅藻演替为80年代的绿藻,又演替为90年代的蓝藻。藻类优势种在一年内也发生着变化,春季和秋季以硅藻门为主,夏季以蓝藻门为主,冬季以硅藻门和绿藻门为主。四尾栅藻是春季和冬季太湖水体中常见的一种绿藻门藻类[1]539。一般认为,在低CO:浓度或高pH的水体中,蓝藻往往成为优势种,而在相反的条件下,绿藻和硅藻将占优势[2]54。目前,国内外学者对四尾栅藻的研究主要集中在其与铜绿微囊藻的竞争机制[1]538.[3“],但有关单营养盐对其生长过程中一些生理参数的影响却鲜见报道。自从MARTIN等口1报道了富含氮、磷的亚寒带北太平洋地区表面的大洋水体浮游植物由于铁限制造成其生物量低的现象后,铁对藻类生长的影响逐渐受到人们的重视。之后,海洋藻被广泛用作为研究对象,而对淡水藻的研究却很少。近几年,吕秀平等‘6]318t[71曾研究了铁对铜绿微囊藻和浮游颤藻生长和光合作用的影响。随着太湖蓝藻的爆发,研究铁对四尾栅藻生长的影响有一定的现实意义。l材料与方法1.1主要仪器和设备光照培养箱、显微镜、血球记数板、离心机、721分光光度计,U2001紫外可见分光光度计等。为减少金属污染,所用的玻璃器皿均在1m01/L盐酸中浸泡2~3d,用超纯水冲洗干净,在60℃下烘干,121℃下高压灭菌20min后备用‘6]318。1.2藻种试验用四尾栅藻购自中国科学院武汉水生生物研究所,编号FACH&44。第一作者:刘静,女,1984年生,硕士研究生,研究方向为植物营养学。8通讯作者。·61· 万方数据环境污染与防治第30卷第8期2008年8月1.3培养基的配置无铁SE培养基:K2HP0。·3H20O.075g/L,CaCl2·2H20O.025g/L,KH2Po;O.175g/L,NaN03O.25g/L,MgS04·7H200.075g/L,NaCl0.025∥L,氏+Co溶液(HBQ2.86∥L,M崛12·H201.81g/L,ZnS04·7H20o.222g/L,CuS04·5H20o.079∥L,№Mo·2ROo.390g/L,c0(NQ)2·6心Oo.049∥L)1mLo标准SE培养基:无铁SE培养基中加入FeCl3·6H2018484nmol/L。培养基:以无铁SE培养基为基础、1000ooOnmol/L的FeCl。·6H。O溶液为母液,配置成不同初始Fe3+浓度的培养基。实验中分别使初始Fe3+摩尔浓度为O、10、100、1ooO、10000、30ooOnmol/L。实验选用250mL广口三角瓶,内装150mL培养基,用无菌封口膜封住瓶口,每个初始Fe3+浓度设3个平行样,121℃高压灭菌20min后备用。1.4生物量标准曲线的测定将四尾栅藻接种到标准SE培养基中得到藻液,在培养温度为(25±1)℃、光强为2ooOlx、光暗比为12h:12h的培养条件下,培养至指数生长期。第15天时,取一定量的藻液,不同倍数稀释后,用721分光光度计分别测定其在650nm处的吸光度(A。。。)。另再吸取1mL藻液放人事先加入50“L鲁格试液的胶卷盒中,染色固定后,用血球记数板在显微镜下记数[8]14。生物量用藻液中的藻个数表示。以四尾栅藻的生物量与吸光度的对应关系绘制成标准曲线:N—A650×136.08十3.4756,R2一O.9961(1)式中:N为藻个数,个/mL。1.5藻细胞的比增长率测定按下式计算藻细胞的比增长率[9。:口一(InN2一lnNl)/(f2一£1)(2)式中:口为比增长率,d~;f。、£2为培养时间,d;N1、N。为培养f,、£。时的藻个数,个/mL。1.6叶绿素a浓度的测定根据改良的JEFFREY等[1阳方法,取5mL藻液经o.45肛m微孑L滤膜过滤,滤膜于一8℃冷冻干燥(过夜或12h以上),然后剪碎放入50mL离心管中,加入少量80℃的95%(体积分数)乙醇,于暗处静置6h后过滤,滤液定容至10mL,用U2001紫外可见分光光度计在663、646啪下比色。按下式计算:c。=(12.21×A663—2.81×A646)×Vl/V2(3)-62·式中:c。为叶绿素a的质量浓度,mg/L;A6。3、As.s分别为663、646nm下的吸光度;V。为定容体积,mL;V。为比色体积,mL,实验中V。为5mL。1.7培养方法和实验条件四尾栅藻实验前进行扩大培养,在指数生长期时离心收集细胞(5ooor/min,15min),用无铁SE培养基洗涤2次,然后用无铁SE培养基饥饿培养5d后离心收集细胞,用少量无铁SE培养基重悬得到重悬液作为藻源,接种到培养基中,接种密度为3×104个/mL,平行样间的相对偏差小于10%时,实验数据取自3个平行样的均值。培养时间为30d,培养期间,每天定时摇动3~4次,并变换位置,以减少光照的影响。每3天取样测定叶绿素a浓度、生物量[8]14。整个实验均在恒温培养室中进行,培养条件同1.4节。整个实验过程均保持无菌操作。2结果与讨论2.1初始Fe3+浓度对四尾栅藻生长的影响不同初始Fe3+浓度下四尾栅藻的生长曲线见图1。从图1可见,生物量随着初始Fe3+浓度的增加而提高。不同初始Fe3+浓度生物量间的差异在第1次取样即第3天时,已显现。这与胡小贞等n1]研究四尾栅藻的生长周期后的发现一致,认为四尾栅藻在接种后的第2天即可进入指数生长期。初始Fe3+摩尔浓度为O、10nmol/L时,四尾栅藻生长曲线基本相似,生物量较低,细胞生长明显受抑制;初始Fe3+摩尔浓度为100nmol/L时,四尾栅藻生物量略高于初始Fe3+摩尔浓度为lOnmol/L的生物量;初始Fe3+摩尔浓度为l000nmol/L时,四尾栅藻生物量则显著高于初始Fe3+摩尔浓度为100nmol/L时的生物量,增幅为23.19%;初始Fe3十摩尔浓度为10000、30000nmol/L时,两者四尾栅藻的生长曲p龟●七莹≤O3691215182l242730时间/d图1不同初始Fe3+摩尔浓度下四尾栅藻的生长曲线Fig.1EffectofFe3+concentrationonthegrowthpro“lesofSfP聍edesm"sglmdric口“d口拈加峦加:2m,0 万方数据刘静等铁对四尾栅藻生长的影响线大致相似,但在生长后期差距较大。不同初始Fe3+浓度下四尾栅藻的比增长率和最终生物量见表1。从表1可见,初始Fe3+摩尔浓度为Onmol/L时,四尾栅藻指数生长期比增长率、平均比增长率和最终生物量均最低,说明缺铁影响了四尾栅藻的生长;初始Fe3+摩尔浓度为10000、30000nmol/L时,四尾栅藻指数生长期比增长率接近,30000nmol/L的四尾栅藻平均比增长率和最终生物量略高于10000nmol/L。这说明初始Fe3+摩尔浓度超过10000nmol/L时,四尾栅藻生长受到的促进作用仍存在,但不显著,而且初始Fe3+摩尔浓度为30000啪ol/L时,四尾栅藻的生长未受抑制。表1不同初始Fe3+摩尔浓度下四尾栅藻的比增长率和最终生物量比较Table1FinalquantityandspecificgrowthrateofSc已行Pd已s7”“sq蚴dric盘“d口grewunderdifferentFe3+concentrations2.2初始Fe3+浓度对四尾栅藻叶绿素a浓度的影响不同初始Fe3+浓度下四尾栅藻叶绿素a浓度随时间的变化见图2。从图2可见,叶绿素a浓度随时间的延长、初始Fe3+浓度的增加而增加。初始Fe3+摩尔浓度为0、10nmol/L时,两条曲线接近,叶绿素a浓度最少,最终叶绿素a质量浓度分别为0.34、O.36mg/L;初始Fe抖摩尔浓度为100nmol/L时,最终叶绿素a质量浓度为o.44mg/L;初始Fe3+摩尔浓度增加至1000nmol/L时,最终叶绿素a质量浓度为O.62mg/L,显著多于O、lO、100nmol/L时的叶绿素a浓度;初始Fe3十摩尔浓度增加为10000nmol/L时,最终叶绿素a质量浓度达到O.95mg/L,是1000nmol/L时叶绿素a浓度的1.53倍;初始Fe抖摩尔浓度为30ooonmol/L时,最终叶绿素a质量浓度为1.05mg/L,虽多于10000nmol/L时的叶绿素a浓度,但两者差异不显著。从图1和图2可见,四尾栅藻叶绿素a浓度随时间的变化曲线与生长曲线相似,随初始Fe3+浓度的增加而增加,但初始Fe3+浓度对四尾栅藻叶绿素a浓度的影响总体比对生物量的影响大。单细胞叶绿素a浓度(最终叶绿素a浓度/最终生物量)随初始Fe3+浓度的增加逐渐增加(见表2)。这可能是因为铁是叶绿素重要的物质组成部分,PRASSAD等‘123研究认为重金属可影响与叶绿素合成有关的酶活性。1.21.OSn8∞0.6昌鼍一o.4n2OO,3691215182l242730时间,d图2不同初始Fe”摩尔浓度下四尾栅藻叶绿素a浓度随时间的变化曲线Fig.2EffectofFe3+concentrationonthechlorophyllacontentprofilesofScP挖已dP5,咒“sqMⅡdrifn“d口表2不同初始F分+摩尔浓度下四尾栅藻单细胞叶绿素a浓度Table2ChlomphyllacontentsofSf删PdPsm“5口纰d—m砒grewunderdifferentFe3+concentrations初始Fe3+摩尔浓度单细胞叶绿素a质量浓度/(nm01·L一1)/(10一9mg·个一1)O101001OOO1000030OOO2.3初始Fe3+浓度对四尾栅藻细胞表面结构的影响选择缺铁、正常、铁过量状态,即初始Fe3+摩尔浓度为o、10ooo、30000nmol/L下的四尾栅藻细胞作扫描电镜分析,结果见图3。从图3可见,3种四尾栅藻细胞均未出现细胞破裂或自融现象,且细胞外型无明显差别;初始Fe3十摩尔浓度为30000nmol/L时细胞壁有缩水打褶现象,其原因不排除扫描电镜样品在前处理过程中细胞脱水所导致;初始Fe3+摩尔浓度为0、30000nmol/L时细胞表面絮状物比10000nmol/L时略多,这些絮状物可能是四尾栅藻细胞的分泌物。因为在异常状态时,四尾栅藻细胞会分泌出一些抵抗不利生长条件的分泌物。3讨论YAN等[13]认为,金属离子对藻类的毒性主要通过以下途径:金属离子与藻细胞壁表面含硫、氮和氧的基团结合后,通过影响藻类的光合作用、呼吸作·63· 万方数据环境污染与防治第30卷第8期2008年8月【aJ毫Ⅱ始Fe“摩尔浓度(b)仞始Fe“荤尔浓度为011lTlol/L为10000nmol,L(c)初始}’e“摩尔浓度为30【x】0nmol,L图3四尾栅藻细胞扫描电镜图Fig.3SEMphotomicrographsofalgaece】lsgrew用和酶活性,从而抑制藻类的正常生长。但实验结果显示,高浓度铁不抑制四尾栅藻的生长。这与EUGENE等[1胡研究结果一致。他们认为,细胞膜的化学性质和结构特点随着藻种类而变化,因此不同的微植体对金属的吸收能力不同。四尾栅藻生物量随着初始Fe3+浓度的增加而提高,这与铜绿微囊藻的情况有所不同。0MAR[153研究了Zn2+对斜生栅藻和四尾栅藻生长的影响。结果显示,当Zn2+达到8.0mg/L时才表现出对四尾栅藻生长的抑制作用。陈海柳等¨”8曾研究了六价铬对淡水蓝绿藻生长的毒性效应,认为四尾栅藻对六价铬的耐受性比其他几种蓝绿藻(羊角月牙藻、钝顶螺旋藻、极大螺旋藻、聚球藻、蛋白核小球藻)强,可能原因是四尾栅藻细胞可通过分泌胞外物质(如有机螯合物)来束缚有毒金属离子,也可利用胞内金属硫蛋白将金属离子封闭在细胞内的某些部位(如液泡、线粒体、细胞核等),从而降低其毒性。T1NG等[16]认为,四尾栅藻具有合成金属结合蛋白的能力,并作为它的一种解毒机制。本实验结果揭示的四尾栅藻对铁有较强的耐受性,也许可归结为四尾栅藻细胞具有较高的外排作用和胞内解毒作用。因为在初始Fe3+摩尔浓度达30000nmol/L时,四尾栅藻仍能正常生长,且其结构未遭受明显的伤害。四尾栅藻不仅对铁等金属具有较强的耐受性,而且对其他环境的适应性也很强。杨波等心]s7发现,四尾栅藻对pH的适应范围较广,具有较强的耐酸性和耐碱性,且在不同pH下的光合速率都较高。刘春光等口73通过研究发现,铜绿微囊藻的生长受光·64·照与磷的交互作用影响较大,而四尾栅藻所受影响相对较小。因此,结合本实验结果,可推测在一些特殊环境中,这些特性均将有利于四尾栅藻与铜绿微囊藻竞争而成为水体中的优势种。4结论(1)初始Fe3+摩尔浓度在O、10nmol/L时,四尾栅藻的生长受到抑制。(2)初始Fe3+摩尔浓度超过10ooonmol/L时,四尾栅藻生长受到的促进作用仍存在,但不显著;初始Fe3+摩尔浓度增加至30000nmol/L时,四尾栅藻生长未受到抑制。(3)四尾栅藻叶绿素a浓度随时间的变化曲线与四尾栅藻生长曲线相似,随初始Fe3+浓度的增加而增加。(4)不同初始Fe3+浓度对四尾栅藻细胞表面结构影响不明显。参考文献[1]胡小贞,金相灿,储昭升,等.太湖铜绿微囊藻与四尾栅藻的光竞争及模拟优势过程初探[J].农业环境科学学报,2005,24(3).[2]杨波,储昭升,金相灿,等.cOz/pH对三种藻生长及光合作用的影响[J].中国环境科学,2007,27(1).[3]陈德辉,刘永定,袁峻峰,等.微囊藻栅藻共培养实验及其竞争参数的计算[J].生态学报,1999。19(6):908—913.[4]杨苏文,金相灿,姜霞.铜绿微囊藻,四尾栅藻和小环藻竞争实验培养基的选择[J].生态环境,2006,15(1):129—133.[5]MARTINJH,FITzwATERsE.1rondeficiencylimitsphyto—planktongrowthinthenorth—eastsubarcticPacific0cean[J].Nature,1988,331(6154):341—343.[6]吕秀平.胡晗华,张栩,等.Fe3+对浮游颤藻生长和光合作用的影响[J].水生生物学报,2005,29(3).[7]吕秀平,张栩,康瑞娟,等.Fe3+对铜绿微囊藻生长和光合作用的影响[J].北京化工大学学报,2006,33(I):z7—30.[8]陈海柳,潘纲,闫海,等.六价铬抑制淡水蓝绿藻生长的毒性效应[J].环境科学,2003,24(2).[9]陈静峰,翁焕新,孙向卫.磷、铁营养盐的交互作用对隐藻(crypfomnnssp.)生长影响的初步研究[J].海洋科学进展,2006.24(1):39—43.[10]JEFFREYsw,HuMPHREYGF.Newspectrophotomericequationsfordeterminingchlorophynsa'b,cland。zinhigherplants,algaeandnaturalphytoplankton口].Biochem.Physi01.Pflanz.。1975,167(5):191—194.[11]胡小贞.马祖友。易文利,等.4种不同培养基下铜绿微囊藻和四尾栅藻生长比较[J].环境科学研究.2004,17(增刊):55—57.[12]PRAssADDK,PRASsADARK.A1tered争aminolaevu.1inicacidmetabolismbyIeadandmercuryingerminatingseed—lingsofBajra(PPn月i5以“mfyp^oidP“m)[J].JournalofP1antPhysiology,1987。127(2):241—249.[13]YANHan,PANGang.Tox.cityandbioaccumulationofcop—perinthreegreenmicroalgalspecies[J].chemosphere,2002.49(5):47l一476.(下转第68页) 万方数据环境污染与防治第30卷第8期2008年8月有很好的相关性,所以反应器对氯化消毒副产物前体的良好去除作用,对于后续常规工艺降低氯耗和减少消毒副产物生成量有十分重要的意义。由图5可见,COD、ToC及UVz。;去除率都随着其进水浓度的增加而升高,3个指标的峰高和峰谷基本对应。UV嘲的去除率不高,说明水中腐殖质去除率不高,因而造成河水中有机物浓度增加的主要是易降解成分,可能是漕河泾水由于接纳污水而造成的。硝化细菌产生的溶解性产物可被异养菌分解H⋯,所以硝化细菌能促进异养菌生长。在此HRT(20min)条件下,反应器对有机物的去除能力相对稳定,说明异养菌的生长对硝化作用没有明显的影响。2.2.4浊度的去除因下雨或涨落潮,进水浊度变化很大。由图6可见,进水浊度在7.5~55.6NTU,出水浊度在2.O~23.8NTU,其去除率为9.4%~88。3%,平均为53.7%;当进水浊度高时,去除率相应也高。反应器对浊度有良好的去除效果,主要通过接触凝聚和微生物的微絮凝作用使原水胶体的一部分脱稳,形成细小絮凝体而降低浊度,因反应器载体充填率低,不会有堵塞的危险,浊度的升高对反应器影响不大,可使后续常规处理工艺的负荷得到降低。星籍l23456789】0时间,d图6浊度的去除情况(HRT=20min)Fig.6Profilesofin&outandremovalofturbidity(HRT=20min)3结语孚糌遴稍(1)自然挂膜法及最佳HRT的确定,为以后工程实际运行提供了依据。HRT约为20rnjn时,氨氮去除率稳定在86.7%~96.2%,平均91.1%。此反应器能承受较强的冲击负荷,能高效快速修复污染的地表水,并且载体充填率低,具有很大应用潜力。(2)反应器不仅能够有效去除地表水中的氨氮、浊度、有机物、TP,对难生物降解的有机物Uv2;。也有一定的去除效果。在HRT为20rIlin时,对氨氮、TP、COD、T0c、浊度和Uv2。。的去除率分别为·68·86.7%~96.2%、4.5%~34.4%、15.5%~63.6%、5.8%~38.1%、9.4%~88.3%和3.8%~48.5%。(3)蜂窝陶瓷载体比表面积大,极易形成生物膜,载体表面的生物膜很薄,有利于D0的穿透,泥量较少。该反应器具有很大的空隙,不会有堵塞的危险,气量很少就能达到很好的传质效果,降低了运行费用,增厚的污泥可通过加大气量冲刷掉,反冲洗简单。(4)气升式内循环蜂窝陶瓷反应器具有很大的市场发展前景,可作为预处理工艺与常规净水工艺联用,或用于景观水的治理,是改善污染地表水水质的有效途径。参考文献[1]李兰贵.地表水环境恶化的危害及治理对策[J].地下水,2002,24(4):243—245.[2]cHENzbenlou,xUshjyuan,XUQjxin,eta1.SurfacewaterpolIutioninYangtzeriverdelta:patternsandcountermeasure8[J].Pedosphere,2002,12(2):11卜120.[3]李海波,李培军,张轶。等.静止或缓流污染地表水微生物固定化修复技术研究进展[J].生态学杂志,2005,24(5):561—566.[4]金晓云,俞国平.微污染原水生物预处理填料选型[J].净水技术,2003,22(2):46—48.[5]张永明。俞俊棠,王建龙,等.蜂窝陶瓷固定化细胞气升式内循环生物反应器的水力学特性口].环境科学。2001,22(1):54—56.[6]梅翔.陈洪斌,张全兴,等.水源水生物处理工艺启动中氨氮的去除[刀.重庆环境科学,2001,23(1):50—52.[7]王占生,刘文君.微污染水源饮用水处理[M].北京:中国建筑工业出版社,1999.、[8]国家环境保护总局《水和废水监测分析方法》编委会.水和废水监测分析方法[M].4版.北京:中国环境科学出版社,2002.[9]姚秀芹,万维纲.化学需氧量(coD)测定法存在问题探讨[J].环境污染与防治,1994,16(2):43—45.[10]RITTMANNBE,MccARTYPL.EnvironmentaIbiotech—nology:principlesandapplications[M].NewYork:McGraw-Hill。2001.责任编辑:陈泽军(修改稿收到日期:2008一02—28)H卜-+—+-+——._-+-+-—+.-+-+·—卜-—卜——卜——卜-+-+-—卜-+-—●--—卜-—}呻-·●一(上接第64页)[14]EUGENET,PREMUzICE,LINM,eta1.selectivityinmetaluptakebystationaryphasemicrobialpopulations[J].Ar—chivesofEnvironmentalContaminationandToxicology.1991,20(2):234—240.[15]OMARHH.BioremovalofzincionsbySc研8dPsmns06fig““jandScPH#dPs研“sq“口dricn“d口anditseffectongrowthandmetabolism[J].InternationalBiodeterioration&Biodegrada—tion,2002,50(2):95一lOO.[16]TINGYP,PRlNcEG,LAws0NF.uptakeofcadmiumandzincbythealgaChfo,苫Zfnt,zlZg口ris:Ⅱ.MuIti—ionsituation口]-Bi叭echn0109yandBioengineering,1991,37(5):445—455.[17]刘春光,金相灿,邱金泉,等.光照与磷的交互作用对两种淡水藻类生长的影响[J].中国环境科学,2005,25(1):32—36.责任编辑:黄苇(修改稿收到日期:2008一04一08)

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