浙江大学生物化学实验甲不同植物SOD提取及活力测定

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1、不同植物SOD提取及活力测定1、SOD简介超氧化物歧化酶（SOD）是一种广泛存在于动、植物和微生物中的金属蛋白酶，是一种重要的抗氧化剂，可清除自由基，其清除自由基的反应如下：生物体在长期的生命活动中，常常会因为环境因素或生理条件的变化而出现氧自由基增加、抗氧化能力降低的情况，并由此引发一系列疾病。如脂质的过氧化与膜疾病、肿瘤、衰老、心血管疾病、创伤、辐射损伤、高度中毒等。O2+O2+2H+H2O2+O2SOD．．不同植物SOD提取及活力测定SOD由于可以清除氧自由基，因此可以防止这些疾病的产生。而且，SOD还可作为一种添加剂，添加到化妆品和食品中，在预防和治疗由于自由

2、基增多而引起的一系列疾病和延缓衰老方面起到一定作用。2、活性测定原理SOD活性测定的方法很多，常见的有化学法，免疫法和等电聚焦三种，其中以化学法应用最普遍。不同植物SOD提取及活力测定本试验即采用化学法来测定SOD的活性，使用的试剂为氮蓝四唑（NBT），NBT在光照下能与O2．发生光化还原反应生成蓝色甲潛（qian），该化合物在560nm处具特征光吸收，而SOD能抑制NBT的光化还原，有关的化学反应式如下：不同植物SOD提取及活力测定核黄素，TEMEDO2O2光照．还原剂NBT+O2甲（qian）蓝色，560nm处具特征光吸收，OD值与O2含量成正比。光照．．SOD光

3、照NBT+O2抑制反应．抑制原因：SODO2+O2+2H+H2O2+O2．．SOD对NBT光化还原的抑制程度与SOD活性成正比，故可通过比色法测出SOD的抑制率，以抑制光化还原反应的50%为一个活力单位，即可计算出SOD的活力。不同植物SOD提取及活力测定3、试验步骤各步试验步骤及注意事项解说祥见p118。4、实验结果及处理SOD活性计算公式：OD对照-OD测试OD对照10050××稀释倍数WSOD活性（u/g鲜重）=（二）SOD同工酶活性染色1、SOD同工酶简介在高等生物的组织和器官中普遍存在着SOD同工酶，按其结合的金属离子的不同可分为：Fe-SOD，Mn-SOD

4、，Cu、Zn-SOD三种，这三种酶均能催化氧自由基的清除反应。Fe-SOD，Mn-SOD在蛋白质一级结构、空间结构、分子量、光谱性质及对不同抑制剂的敏感性等方面与Cu、Zn-SOD差别较大。（二）SOD同工酶活性染色Mn-SOD在真核生物中多为四聚体，在原核生物中为二聚体。Fe-SOD大多数为二聚体。这两种SOD的许多性质都很相似，如两种酶的一级结构和空间结构均很相似，每个亚基的分子量一般均为23000D，并含有0．5~1．0个Mn或Fe原子。不同来源的Fe-SOD和Mn-SOD其一级结构的同源性均很高。（二）SOD同工酶活性染色Cu、Zn-SOD则一般是由两个相同的

5、亚基组成的二聚体，每个亚基的分子量约为16000D，含一个铜原子及一个锌原子，不同来源的Cu、Zn-SOD其一级结构的同源性也很高。2、SOD同工酶活性染色原理由于三种SOD同工酶的分子量和电荷间存在差异，因此可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法将三种SOD同工酶分开。（二）SOD同工酶活性染色电泳完后，根据SOD活性测定原理，将NBT溶液加入凝胶，在光照下，凝胶中不含SOD的地方，由于NBT进行光化还原生成蓝色甲潛，因此凝胶呈蓝色；而在SOD同工酶谱带处，由于SOD抑制NBT的光化还原，无蓝色甲潛的生成，因此凝胶透明，即蓝色背景下的透明带即为SOD同工酶谱带。通过这种方法，可

6、观察到不同来源SOD同工酶之间以及同一来源不同发育阶段之间SOD同工酶的差异。（二）SOD同工酶活性染色3、材料与试剂试验材料：新鲜植物叶片。试验试剂：详见P117。4、操作方法各步操作方法及注意事项解说详见P118。5、实验结果及处理仔细观察活性染色后SOD同工酶谱带的显示情况，据此绘制SOD同工酶图谱并对图谱进行简要说明。