翻译好的 罗氏公司Tunel试剂盒操作说明书

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1、罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书(Insitucelldeathdetectionkit-POD法)一、原理：TUNEL（TdT-mediateddUTPnickendlabeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdTEnzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radishperoxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（

2、DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含：1号（蓝盖）EnzymeSolution酶溶液：Td

3、T10×、2号（紫盖）LabelSolution标记液：荧光素标记的dUTP1×、3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5μl20×DAB+1μL30%H2O2+94μlPBS）、ProteinaseK工作液（10-20μg/mlin10mMTris/HCl，pH7.4-8）或细胞通透液（0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase1（3000U/ml–3U/mlin50mMTris-H

4、Cl，pH7.5，10mMMgCl2，1mg/mlBSA）等。三、实验步骤操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）：1.用二甲苯浸洗2次，每次5min；2.用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理4.用ProteinaseK工作液处理组织15-30min在21–37°C（温度、时间、浓度均需摸索）如果凋亡细胞染色较弱时，可用高浓度的ProteinaseK（400μ

5、g/mL）处理5分钟。其它替代方法：石蜡切片的预处理也可根椐实际情况可采用下述三种替代方法之一，即蛋白酶K处理的步聚改用下述方法，其余步聚均相同：替代方法1:将脱蜡及水合好的切片浸入通透液中8-10min（通透液：0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠，需新鲜配制）替代方法2：将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中8-10min（胃蛋白酶：0.25%-0.5%溶于HClPH2，胰蛋白酶0.25%-0.5%溶于0.01NHCl）替代方法3:将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml0.1M的柠檬酸缓冲液PH6的塑料盒中，置于微波炉中350W（低档）处理5

6、min。5.PBS漂洗2次；6.制备TUNEL反应混合液：处理组用50μl1号液+450μl2号液混匀；而阴性对照组仅加50μl2号液，阳性对照组先加入100μlDNase1，反应在15~25℃×10min，后面步骤同处理组。7.玻片干后，加50μlTUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl2号液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。8.PBS漂洗3次；9.可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm）；10.玻片干后加50μl3号液（converter-POD）于标本上，加盖玻片或封

7、口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。11.PBS漂洗3次；12.在组织处加50~100μlDAB底物，反应15~25℃×10min；13.PBS漂洗3次；14.拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。15.加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计200~500个细胞）并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状/凋亡小体）对于培养细胞的预处理：①在

8、载玻片上铺