甲基化检测技术比较

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1、甲基化检测技术比较欧易生物甲基化研究技术甲基化检测DNA甲基化的检测大体分为两个步骤：a．待检测样品的前期处理；b．目标序列的定位和甲基化状态的量化。甲基化的前期处理•重亚硫酸盐修饰•甲基化特异性内切酶•蛋白或抗体富集重亚硫酸盐修饰5甲基化特异性内切酶蛋白或抗体富集MeDIP:MethylatedDNAImmunoprecipitationMeDIP全基因组甲基化分析•甲基化芯片(Illumina/Agilent)•甲基化免疫共沉淀测序(MeDIP-seq)•亚硫酸氢盐处理测序(BisulfiteSequencing）9甲基化芯片--亚硫酸盐修饰CH3ggggagCag

2、CatggagCCttCGgCtgaCtggCGtggCCatopstrandCCCCtCgtCgtaCCtCggaaGCCgaCtgaCCGCaCCggtbottomstrandCH3亚硫酸盐转化CH3ggggagUagUatggagUUttCGgUtgaUtggUGtggUUatopstrandUUUUtUgtUgtaUUTUggaaGCUgaUtgaUUGUaUUggtbottomstrandCH3处理后上下链不再互补针对转化后的序列设计芯片探针10Infinium技术检测甲基化--单碱基延伸原理11HumanMethylation27K•>27，578个Cp

3、G位点•涵盖了14，475个RefSeq基因，注释过的基因12，833个•144个已经确认的癌症基因的甲基化位点,982个文献报道过的癌相关基因的位点•200个存在于CpG岛上•110个探针分布于miRNA启动子区域12HumanMethylation450K•>450,000个CpG位点•CpG岛或CpGshores位点；•CpG岛外的CpG位点；•在人类干细胞中观察到的非CpG岛甲基化位点；•肿瘤与正常组织相异的甲基化位点，包括多肿瘤及不同的组织类型；•非编码区CpG岛位点；•miRNA启动子区域；•由GWAS项目发现的疾病相关区域位点。13甲基化芯片--MeDIP

4、-chip1.将基因组DNA超声打断成400bp-500bpDNA片段；2.加热变性并将变性后的单链DNA样品分成两份；3.其中一份单链DNA样品加入抗5’-甲基化胞嘧啶核苷抗体。4.使用免疫磁珠法分离3步样品中甲基化DNA片段的抗体复合物，样品中其余的非甲基化DNA片段被洗脱；5.纯化免疫共沉淀的DNA片段（MeDIP）；视需要可对MeDIP与Input样品进行扩增；6.对MeDIP(Cy5)与Input(Cy3)样品分别进行标记；7.标记后的MeDIP与Input样品混合、变性，与DNA微阵列芯片杂交；8.用高解析度芯片扫描仪检测杂交信号；对杂交结果进行数据提取、标

5、准化、峰值分析、报告。14AgilentCpG岛甲基化芯片•在Agilent公司定制的Promoter芯片，绝大多数基因是针对基因的启动子区域的CpG岛设计探针。•共有4160个功能注释比较明确的基因，2128个和肿瘤发生有关系•从功能上分：256个基因和细胞凋亡有关1273个基因和信号传导有关487个基因和压力与衰老有关15大肠癌甲基化芯片筛选•实验材料：3组大肠癌及癌旁样本•共有240个差异显著的CpG，最终筛选出与之对应的174个差异基因•任意挑选3个基因验证，结果与已发表文献结果一致16MeDIPSequencingDNA片段化抗体富集建库测序生物信息学分

6、析17技术策略BisulfiteSequencing片段化亚硫酸氢盐处理建库测序数据分析19Bisulfite-seqVSMeDIP-seqBisulfite-SeqMeDIP-Seq高，可以精确得到单个碱基相对较低，能够在实际结合位点50个分辨率C的甲基化状况碱基范围内精确定位1.5X基因组大小，以人为例，2~3G数数据量10X基因组起据即可价格高低获得全基因组高分辨率甲基不同临床样本之间的比较，尤其是大最优适用化图谱样本量的比较研究特异甲基化位点检测•BSP（亚硫酸氢盐PCR测序）•HRM(高分辨率熔解曲线)•焦磷酸测序21BSP(Bisulfatesequenci

7、ngPCR)挑克隆测序用于特定基因已知和未知甲基化位点检测22精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态及程度，但需要大量克隆测序。23HRM高分辨熔解曲线分析HRM技术：用于筛选大量样本，获得感兴趣的CpG位点深入分析鉴定感兴趣的CpG岛扩大样本量进行深入分析24HRM技术原理溶解曲线分析鉴定感兴趣的CpG岛25通过HRM，结合标准样本，可对未知样品中甲基化的程度进行准确测定。26焦磷酸测序流程检测平台QIAGEN：PyroMarkQ96ID平台结果分析BSPvsHRMvsPyroseqBSPHRMPyroseq扩增长度