抑癌蛋白UBIAD1在高尔基体定位信号的分析

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1、华中科技大学硕士学位论文摘要UBIAD1蛋白与由脂代谢异常引起的施耐德角膜营养不良SCD（Schnyder’scornealdystrophy），帕金森神经疾病，多种人体癌症以及维他命K合成有关。UBIAD1在细胞中的亚定位目前在国际上尚无定论。由于UBIAD1蛋白可作为人体膀胱癌的抑癌因子，我们研究了其在人胚肾细胞HEK293及人体膀胱癌细胞系J82和T24的亚细胞的定位。利用生物化学与细胞生物学的方法，我们将全长UBIAD1基因、UBIAD1基因的片段、基因定点突变的UBIAD1与编码绿色荧光蛋白的质粒pEGFP-N1相连，转染HEK293细胞，

2、通过观察绿色荧光蛋白的位置来确定其在细胞内的定位和转运，体外过量表达结果与通过免疫组化得到的结果一致。我们首次观察了UBIAD1定位在高尔基体上。通过观察UBIAD1蛋白片段的亚细胞定位我们发现其N-端对其在高尔基体上的定位有重要影响，而且将UBIAD1的N-端与仅定位于细胞膜上的蛋白（orail1）相连后，可使orail1定位于高尔基体上。生物信息学分析结果显示UBIAD1的N-端54-57位的氨基酸序列RPWS作为高尔基体定位信号影响其在高尔基体上滞留。我们这一预测结论通过定点突变实验得以印证，发现RPWS信号可以作为UBIAD1蛋白在高尔基体的

3、滞留信号。RPWS在UBIAD1的N端可以形成一个精氨酸指（Argininefinger）结构来帮助UBIAD1蛋白定位在高尔基体上。用BrefeldinA处理HEK293细胞后发现UBIAD1蛋白在高尔基体上的定位受到破坏，因此UBIAD1很可能是通过COPII小泡从内质网转运至高尔基体上。为检测RPWS突变是否影响UBIAD1的抑癌活性，将UBIAD1（RPWS突变）转染T24细胞系，经过流式细胞仪检测，与正常的UBIAD1蛋白相比，突变型UBIAD1导致的细胞后期凋亡率下降，表明UBIAD1在高尔基体上的定位影响其正常功能。关键词：UBIAD1

4、，亚细胞定位，Golgi滞留信号，胞内转运，抑癌因子I华中科技大学硕士学位论文AbstractUBIAD1isinvolvedindyslipimedia-inducedSCD(Schnydercrystallinecornealdystrophy),Parkinson’sdisease,multiplehumancancersandvitaminKbiosynthesis.CurrentlythesubcellularlocalizationofUBIAD1isnotclear.SinceUBIAD1isatumorsuppressorforbla

5、ddercarcinoma,westudiedthesubcellularlocalizationofUBIAD1inHEK293celllineandbladdercarcinomacellsJ82andT24celllines.InordertostudytheUBIAD1subcellularlocalization,weusedacombinationofbiochemicalandcellbiologyapproaches.FirstweconstructedtheexpressionvectorpEGFP-N1containingfull

6、lengthUBIAD1gene,truncatedofUBIAD1gene,mutantedUBIAD1gene.ThenwetransfectedthecelllineHEK293withthosevectors.Observingthegreenfluorescentproteinbyconfocalmicroscope,wedeterminedthesubcellularlocalizationandtraffingsofUBIAD1.Over-expressionresultsareconsistentwithimmunohistochem

7、icalresults.LivecellfluorescenceimagingresultsindicatethatUBIAD1isco-localizedwithGolgiapparatus,whichisthefirstreportforGolgilocalizationofUBIAD1.TheN-terminusofUBIAD1isvitalforitssubcellularlocalization,sincetheN-terminusofUBIAD1cantargetedaplasmamembraneproteinorail1toGolgi.

8、BioinformaticanalysissuggeststhattheGolgiretentionsign