理化快速检验技术

《理化快速检验技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、理化快速检验技术吉林省疾病预防控制中心2013.6.6什么是酶联免疫分析技术ELISA的基本原理和方法ELISA的种类和变化ELISA的特点ELISA的应用实例1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术

2、(immunoenzymatictechniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。一、基本原理它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固

3、相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成比例。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。其方法简单，方便讯速，特异性强。ELISA的种类和变化（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法（四）双位点一步法（五）捕获法测IgM抗体（六）应用亲和素和生物素的ELISA检测试剂盒：竞争法ELISARandoxbeta兴奋剂检测试剂盒原理：竞争法ELISA•加入待测样品样品含有

4、高浓度待检药物残留样品含有低浓度待检药物残留•加入HRP标记的抗体并混匀样品含有高浓度待检药物残留样品含有低浓度待检药物残留•室温孵育•洗板，之后加入底物液并孵育•加入终止液样品含有高浓度待检药物残留样品含有低浓度待检药物残留测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。ELISA方法所需设备酶标分析仪恒温培养箱恒温摇床移液枪涡动仪离心机ELISA方法需要注意的一些细节未使

5、用的微孔板条需立使用移液槽需仔细标记即放回铝箔袋中，并密封保存ELISA试剂盒使用中的注意事项避免高温条件下储存与运输试剂盒。在室温低于20℃或试剂及标本没有回到室温（20-24℃），会导致所有标准的OD值偏低（非常关键），甚至严重影响结果。孵育、加样和洗涤严格按照试剂盒说明书要求。在产品有效期内（一般12个月）使用，不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。保存试剂盒于2-8℃，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封。试剂颜色发生改变，说明试剂变质，不能再用。如何评价ELISA试剂盒的优劣灵敏度：灵敏度和

6、最低检测限，可简单理解为试剂盒能检测药物最低含量的能力。试剂盒的检测限越低，表明试剂盒的灵敏度越高。准确率：用添加回收率来×100%，用变异系数评价重现性，越低越好。表示，越高越好。回收率（%）=实测值/添加值稳定性：用保存期评价试剂盒稳定性。特异性：常用交叉反应率表示，是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。交叉反应率越小，特异性越高。ELISA试剂盒使用中的常见问题显色结束仍没有颜色或吸光度值偏低试剂盒保存运输不当使用前酶标板已完全干燥酶标抗原未加或稀释度过低或加错温度过低或试剂盒没有回温试剂盒

7、中的酶标抗原失效试剂盒超过有效期ELISA试剂盒使用中的常见问题显色结束整块板吸光度值都很高酶标抗原污染了盒内的其他试剂未进行洗板操作，直接加显色剂标准曲线形态不好，吸光度值偏高主要是酶标抗原的稀释倍数偏低，反应温度过高。抗原稀释时必须按照说明书稀释倍数进行稀释，反应温度在控制合理范围内标准曲线形态不好，吸光度值偏高主要是因为加酶标抗原前未进行洗板操作，酶标抗原的稀释倍数偏高，反应温度过低。同样要严格按照洗板步骤和抗原稀释倍数操作，控制反应温度ELISA试剂盒使用中的常见问题平行性不好主要是加样及试剂量不

8、准确，洗板后孔干燥时间过长，酶标抗原加入时有误差要求定期校准移液器，移液器与移液头要配套，使其吻合紧密，确保准确加入足量标本和试剂。操作时务必保持实验的连贯性，试验的保温温度、时间要一致，洗涤要彻底，不要手工洗板与洗板机洗板互换酶标抗原稀释前注意混合均匀，使用多道移液器进行加入操作ELISA试剂盒使用中的常见问题样品的高阳性率主要是样品处理去脂肪或蛋白不彻底，实验时样品要按要求进行前处理样品的吸光度值低于零标准孔引起的因素主要