羧甲基纤维素_壳聚糖胶囊固定化蔗糖酶

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1、河北科技师范学院学报第25卷第2期,2011年6月JournalofHebeiNormalUniversityofScience&TechnologyVo.l25No.2Jun,2011羧甲基纤维素-壳聚糖胶囊固定化蔗糖酶*杨婷,侯文龙,牛少莉,刘晓敏,段志青,杨越冬(河北科技师范学院理化学院,河北秦皇岛,066004)摘要:利用复凝聚法制备了粒径约3.0mm的羧甲基纤维素-壳聚糖胶囊,并用其固定化蔗糖酶。羧甲基纤维素-壳聚糖胶囊固定化蔗糖酶的最佳制备工艺条件是:蔗糖酶溶于质量分数为0.02的壳聚糖溶液,滴入质量分数为0.015羧甲基纤维素溶液中并在其中

2、固化24h。固定化酶耐酸性好,在pH3.6~5.0范围内其活性基本保持不变,而游离酶在pH3.6时其活性仅为最大时的63%;固定化酶的米氏常数(Km=54.11mmol/L)大于游离酶的米氏常数(K=35.62mmol/L)。m关键词:壳聚糖;蔗糖酶;固定化;稳定性中图分类号:Q814.2文献标志码:A文章编号:1672-7983(2011)02-0013-04固定化酶是指被局限在某一特定区域上的、并且保留了它们的催化活力、可以反复、连续使用的酶。与游离酶相比,固定化酶具有下列优点:固定化酶极易与底物、产物分开;可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续

3、反应;在大多数情况下,能够提高酶的稳定性;酶反应过程能够严格控制:产物溶液中没有酶的残留,简化了提纯工艺;较游离酶更适合于多酶反应;可以增加产物的收率,提高产物的质量;[1~7]酶的使用效率提高,成本降低。胶囊法固定化酶最接近自由酶的工作环境,能最大限度地保留酶的活性。在已有的胶囊法固定化酶技术中,利用聚阴离子电解质)))海藻酸和聚阳离子电解质)))壳聚[8~12]糖、聚赖氨酸等间的静电作用形成多电解质络合物囊膜实现酶固定化的报道非常多。羧甲基纤维素是非常廉价的聚阴离子电解质,也可与壳聚糖、聚赖氨酸等聚阳离子电解质形成多电解质络合膜实现酶的固定化,但以羧

4、甲基纤维素和壳聚糖为原料进行胶囊法固定酶的研究未见报道。本试验以壳聚糖和羧甲基纤维素为原料制备羧甲基纤维素-壳聚糖胶囊并用其固定蔗糖酶,考察羧甲基纤维素-壳聚糖胶囊固定化蔗糖酶的可行性。1材料与方法1.1材料和药品酵母;羧甲基纤维素钠(化学纯);壳聚糖(自制,脱乙酰度大于80%);冰醋酸(分析纯);无水乙醇(分析纯);十二烷基硫酸钠(SDS);葡萄糖(分析纯);氢氧化钠(分析纯);3,5-二硝基水杨酸(化学纯);蔗糖(分析纯);醋酸钠(分析纯);丙三醇(分析纯)等。1.2试验方法1.2.1羧甲基纤维素-壳聚糖胶囊的制备用6号注射器的针头将壳聚糖溶液滴入到

5、100mL的CMC溶液中,硬化24h后滤出,用pH4.6醋酸缓冲溶液洗涤后得羧甲基纤维素-壳聚糖胶囊。实验中重点考察壳聚糖浓度、CMC浓度、硬化时间、固定化温度对胶囊形成效果的影响。[13]1.2.2蔗糖酶的制备SDS(十二烷基硫酸钠)抽提法。称取酵母10g,加入60mL0.3mmol/L的SDS溶解,40e水浴12h后取出,4e,12000r/min离心15min,上清液即为粗制酶液。在粗制酶液中加入乙醇使其质量分数达0.30,4e放置过夜,然后在4e下12000r/min离心15min,取上清液,追加乙醇使其终质量分数达0.50,4e放置1h,在4e

6、下12000r/min离心15min,弃上清液,沉淀分为两部分,一部分干燥后测定沉淀中粗酶含量;另一部分用pH4.6醋酸缓冲溶液配制成含粗酶0.3%的酶液,4e保存备用。基金项目:河北省自然科学基金项目(项目编号:B2009000862)。*通讯作者,女,博士,教授。主要研究方向:天然产物化学。E-mai:lhwl_long2002@sina.com。收稿日期:2010-11-06;修改稿收到日期:2011-03-0714河北科技师范学院学报24卷1.2.3羧甲基纤维素-壳聚糖胶囊固定化蔗糖酶的制备取1.2.2制备的粗酶液与10.0mL质量分数为0.02

7、的壳聚糖溶液充分混合,按1.2.1相同的方法制备羧甲基纤维素-壳聚糖胶囊固定化蔗糖酶。固定化蔗糖酶在pH4.6的醋酸缓冲溶液中,4e贮存备用。1.2.4羧甲基纤维素-壳聚糖胶囊的表征¹羧甲基纤维素-壳聚糖胶囊形貌观察:将胶囊用刀片切开后平铺在载玻片上晾干,用SEM观察胶囊表面形貌。º胶囊强度的测定:将胶囊置于离心管中,在3000转/min离心30min后观察胶囊的破碎或保持完整性情况来表征胶囊的膜强度。1.2.5酶和固定化酶活性的测定以煮沸酶液作对照,以1min内催化释放1Lmol还原糖的酶量为1个酶活单位(U)。取2.0mL粗酶液与2.0mL蔗糖溶液(

8、0.2g/L,pH4.6醋酸溶液)混合均匀,于37e[13~14]反应15min