固定化技术在海参壳聚糖酶生产中的应用

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1、固定化技术在海参壳聚糖酶生产中的应用　　壳聚糖酶（Chitosanase，EC3.2.1.99）是一种高效、专一水解壳聚糖制备壳寡糖的酶[1，2]。近年来，利用专一性壳聚糖酶水解壳聚糖制取壳寡糖已成为甲壳素工业的研究热点与前沿[3，4]。目前壳聚糖酶研究多集中于菌种筛选与游离细胞产酶条件等方面。固定化细胞与固定化酶技术对于提高酶的生产与应用效率有重要意义[5，6]。本试验采用多种方法对产壳聚糖酶菌种及壳聚糖酶固定化进行研究，旨在筛选最适固定化细胞及固定化酶的方法。 　　1材料与方法 　　1.1药品与试剂 　　壳聚糖（脱乙酰度≥80%，济南海得贝海洋生物工程公司），海藻酸钠（黏度范

2、围：1.05～1.15，天津市永大化学试剂开发中心），乙酸、NaOH、甲醇、戊二醛、HCl、NaCl、CaCl2等试剂均为国产分析纯。 　　1.2菌种与培养基 　　产壳聚糖酶菌株Yg，廊坊师范学院生命科学学院微生物实验室保存提供。改良PDA培养基：马铃薯（去皮）200g，葡萄糖30g，蛋白胨2g，KH2PO40.5g，（NH4）2SO40.5g，维生素B110mg，蒸馏水1000mL，115℃高压灭菌30min[7]。产酶培养基：KCl5g，NaCl5g，MgSO4·7H2O5g，K2HPO40.75g，FeSO40.01g，蛋白胨8.5g，牛肉膏0.25g，壳聚糖10g，蒸馏水

3、1000mL，pH7.5～8.0，121℃高压灭菌30min[8]。 　　1.3方法 　　1.3.1固定化细胞产壳聚糖酶将Yg菌株于改良PDA斜面上活化2次，而后接种于改良PDA液体培养基，36℃、180r/min培养16h，再用0.75%无菌生理盐水5000r/min离心洗涤2次，每次20min，取菌体沉淀4℃保藏备用。采用3种方法对细胞进行固定化处理：①海藻酸钠包埋法。取2.5%海藻酸钠溶液50mL，加入2g湿菌体，搅拌混匀，用8号针头从离液面10cm高处将其滴入2%CaCl2溶液中，滤出凝胶小球，重新置于2%CaCl2溶液中，4℃静置硬化2h[9]。②海藻酸钠壳聚糖包埋法。

4、2.5%海藻酸钠溶液中加入1%的壳聚糖，配制海藻酸钠壳聚糖胶体溶液。取该溶液50mL，加入2g湿菌体，搅拌混匀，用8号针头从离液面10cm高处将其滴入2%CaCl2溶液中，滤出凝胶小球，重新置于2%CaCl2溶液中，4℃静置硬化2h[10]。③壳聚糖吸附法。将2.5%壳聚糖胶体溶液用8号针头滴入凝结液（20%甲醇和30%NaOH）中，作用2h后得到中空壳聚糖球，取出用去离子水洗涤，而后放入Yg菌悬液中，吸附2h，取出壳聚糖球并用0.75%无菌生理盐水洗涤后备用[11]。 　　将各试验组固定化菌体小球放入改良PDA液体培养基中，36℃、120r/min预培养12h，而后放入产酶培养

5、基中，30℃、120r/min培养24h。过滤取滤液于5℃、5000r/min离心15min，取上清液即为粗酶液并测定其酶比活力。将产酶后的小球过滤回收，去离子水洗涤后再次产酶，观察固定化细胞的重复利用性能[12，13]。 　　1.3.2壳聚糖酶的固定化取上试验中所得壳聚糖酶粗酶液，利用4种方法分别对其进行固定化处理：①壳聚糖吸附法。3%的壳聚糖胶体溶液，用8号针头将其滴入凝结液（20%甲醇和30%NaOH）中，作用2h后得中空壳聚糖球，取出后用去离子水洗涤3次，吸水纸吸干。加入壳聚糖酶液至刚好没过球，吸附3h，取出后去离子水洗涤，收集剩余酶液及洗液并测定其体积，称量壳聚糖球质量

6、[14]。②壳聚糖交联后吸附法。按①法制备壳聚糖球，而后将其加入1%戊二醛溶液中，室温交联6h，去离子水洗涤、吸干。壳聚糖酶吸附方法同①[14]。③酶先交联后壳聚糖吸附法。按①法制备壳聚糖球，取5mL壳聚糖酶液与0.1mL1%戊二醛溶液混匀，作用1h后加入壳聚糖球，溶液没过球即可，3h后取出，用去离子水洗涤，收集剩余酶液及洗液并测定其体积，称量该壳聚糖球质量[15]。④海藻酸钠壳聚糖吸附包埋法。取含5%海藻酸钠、2%壳聚糖的海藻酸钠-壳聚糖胶体溶液5mL与等量的壳聚糖酶液混匀，用8号针头从离液面10cm处将其滴加到2%CaCl2溶液中。滤出凝胶小球，重新置于2%CaCl2溶液中4

7、℃静置硬化2h，滤出凝胶小球用去离子水洗涤，收集前后CaCl2溶液及洗液并测定其体积，称量该凝胶小球质量[14]。 　　测定各试验组固定化壳聚糖酶的酶比活力，计算酶结合效率及酶活力回收率。过滤回收初次反应后固定化酶小球，去离子水洗涤后重复反应，观察固定化壳聚糖酶回收及重复利用效率。 　　1.4酶活力测定及计算方法 　　壳聚糖酶活力测定：将酶液与3%壳聚糖溶液分别预热至45℃，取5mL酶液加入50mL3%壳聚糖溶液中，混匀并于45℃、180r/min条件下作用，定时取出反应液，加1