螺旋纤维床固定化反应器两步法生产壳聚糖酶

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1、!"卷#期微生物学报’()*!"1(*#$%%"年&$月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$+,-,./,0$%%"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!螺旋纤维床固定化反应器两步法生产壳聚糖酶&$吴绵斌黄萍（&浙江大学材料与化工学院生物工程研究所杭州"&%%$4）（$浙江大学药学院杭州"&%%"&）摘要：采用了菌体生长与产酶分步的新工艺利用里氏木霉（!"#$%&’(")*"((+(#）F6GG8#4#!生产壳聚糖酶，酶活力比在相

2、同条件下进行的一步法产酶提高了&H4倍。采用此工艺在螺旋纤维床生物反应器中进行产酶试验，酶活比采用游离细胞培养又提高了"2I，达到%H$!#JK.L。固定化菌丝还能够长期保持活性，在重复分批操作中，经过&%批共&8天的产酶实验，平均每批的酶活保持在%H$"8JK.L左右。关键词：里氏木霉，固定化菌丝，螺旋纤维床生物反应器，壳聚糖酶中图分类号：M3&!文献标识码：F文章编号：%%%&7#$%2（$%%"）%#7%4#!7%8里氏木霉在以葡萄糖为碳源的情况下，菌丝生长较其它碳源更为良好，并能产生少量组成型壳聚糖

3、酶，但只有在氨基葡萄糖存在的情况下，才能诱导产生高活力壳聚糖酶。当浓度提高到某一范围以后，氨基葡萄糖也会阻遏壳聚糖酶的生物合成。这种现象在壳聚［&，$］糖酶生产中较为普遍，很多人采用孢子直接接入诱导培养基的方法生产壳聚糖酶，这样虽然能诱导产生壳聚糖酶，但培养时间长。而且由于缺乏足够的营养元素及合适碳源，菌体会生长不好，酶活力不能得到充分提高。本文在对菌体生长和产酶分离的两步法生产壳聚糖酶培养条件进行优化的基础上，重点对采用螺旋纤维床固定化生物反应器（G(EN()?O,DP=/0(?A/,D/=(0,:-O(

4、0，G9QQ）生产壳聚糖酶进行研究。!材料和方法!"!培养基!"!"!菌株：里氏木霉（!"#$%&’(")*"((+(#）F6GG8#4#!，本实验室保藏，斜面培养采用R+F培养基，$3S培养4$T。!"!"#菌丝生长培养基：每升含葡萄糖8%U，蛋白胨$U，营养盐溶液&%%.L，V:ED,)A微量元素溶液&.L，%H%8.()KL柠檬酸缓冲液调WX8H%。营养盐溶液组成：每升含（1X!）$YZ!&!H%U，[X$RZ!$%H%U，尿素"H%U，G:G)$·$X$Z"H%U，VUYZ!·4X$Z"H%U。V:

5、ED,)A微量元素盐溶液组成：每升含9,YZ!·#X$Z4H%U，VEYZ!·X$Z&H#U，EYZ!·4X$Z&H!U，G(G)$·#X$Z"H4U。!"!"$产酶培养基：每升中含氨基葡萄糖$$8.U，V:ED,)A微量元素盐溶液&.L，吐温3%基金项目：国家自然科学基金资助（$2234#%"#）作者简介：吴绵斌（&2#25），男，浙江宁波人，副教授，博士，研究方向为生物工程。6,)：3#784&73428"%3%；9:;：3#784&73428&"83；<7.:=)：>?./@-.A-,*BC?*,D

6、?*-E收稿日期：$%%$7&&7&&，修回日期：$%%"7%37$8;期吴绵斌等：螺旋纤维床固定化反应器两步法生产壳聚糖酶9;0!"，用!#$%&’柠檬酸缓冲液调()*+,。微量元素盐溶液的组成同上。0以上培养基在!+-./!-12下灭菌3-#45。当研究培养基某一成分对产酶的影响时，可以改变这一成分的浓度。!"#实验方法!"#"!细胞固定化：将里氏木霉孢子悬液接入到螺旋纤维床生物反应器中，接种量为00/!-个&#’，按培养液的06体积比接入，3’（5!+-77#）通气量，.-8条件下培养93:。!

7、"#"#固定化细胞诱导产酶：去除培养基后，用-+-0#$%&’()*+,的柠檬酸缓冲液洗涤菌丝3次，然后再接入产酶培养基，以.’（5!+077#）通气量，3,8培养。!"$实验设备和装置!"$"!固定化细胞培养实验装置（参见文献［;］）：（!）设备和装置：本实验使用反应器为螺旋纤维床固定化反应器（<=>>），结构为带有夹套的玻璃柱反应器（!!!-##/;;-##），载体用不锈钢丝网固定成卷状，反应器底板是直径为0##的多孔筛板，筛孔分布均匀。工作体积为3’。无菌空气从反应器的底部通过筛孔均匀地通入反应

8、器中，培养温度由夹套中恒温水调节。（3）固定化载体：载体为多孔聚氨酯泡沫（1$?$@A($%BCADC?E$2#，11F），空隙率大于G-6，载体重量为!-"，由日本日清纺织株式会社提供。!"%分析方法!"%"!壳聚糖酶活的测定：采用HI:4J2法，每分钟产!"#$%氨基葡萄糖为!H壳聚糖酶活［.］单位。［*］!"%"#还原糖的测定：采用KLM法。［0］!"%"$氨基葡萄糖浓度的测定：采用F:?4I:法。!"%"