内参法在线粒体DNA纯度鉴定中的应用

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1、万方数据麦类作物学报2009，29(6)：1088—1093JournalofTriticeaeCrops内参法在线粒体DNA纯度鉴定中的应用袁正杰，张改生，孙瑞，胡俊敏，位明明，张龙雨，李红霞，陈蕊红，牛娜，马守才(西北农林科技大学陕西省作物杂种优势研究与利用重点实验室／小麦育种教育部工程研究中心，陕西杨凌712100)摘要：为了确定普通差速离心法提取的小麦线粒体DNA(mtDNA)的纯度，以小麦肌动蛋白p亚基(pAc—tin)、1，5一二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶大亚基(RabcL)和细胞色素C氧化酶第三亚基(COXIII)基因的片段作为内参标记，依靠聚合酶链式反应(PCR)及琼脂糖凝胶

2、电泳技术，时提取的mtDNA进行了检测。结果表明，普通差速离心法提取的mtDNA中混杂有核DNA和叶绿体DNA(ctDNA)。对提取的mtDNA稀释后再进行内参法检测，结果发现，当mtDNA稀释到DNA原液的300～400倍时，混杂其中的核DNA已达不到PCR反应的敏感度，但mtDNA、ctDNA仍能满足作为PCR反应体系模板的要求。此时，提取到的mtDNA可视为无核DNA污染的细胞质基因组DNA。关键词：小麦；线粒体DNA；内参法；纯度鉴定中图分类号：$512．1；S312文献标识码：A文章编号：1009—1041(2009)06—1088—06ApplicationofInternal

3、ReferenceMethodinIdentificationofMitochondrialDNAPurityYUANZheng-jie，ZHANGGai—sheng，SUNRui，HUJun。min，WEIMing-ming，ZHANGLong-yu，LIHong-xia，CHENRui—hong，NIUNa，MAShou-cai(KeyLaboratoryofCropHeterosisofShaanxiProvince．NorthwestA&FUniversity，WheatBreedingEngineeringResearchCenter，MinistryofEducation，Ya

4、ngling，Shaanxi712100，China)Abstract：Inthisstudy，thegenespActin，RabeLandCOXIllwereusedastheinternalreferencemarkerstodetectthepurityofmitochondrialDNAextractedusingdifferentialcentrifugationthroughpolymerasechainreaction(PCR)andagarosegelelectrophoresis．TheresultshowedthatmitochondrialDNAextrac—ted

5、usingdifferentialcentrifugationcontainedimpurities，whichincludednuclearandchloroplastDNA(ctDNA)．ThenthemtDNAwasdilutedandthepurityofthedilutedmtDNAwasdetectedusingthesamemethod．ItwasfoundthatthenuclearDNAbecameundetectablebyPCRwhenthemtDNAwasdiluted300—400times．However，themtDNAandctDNAcouldstillbe

6、amplifiedbyPCR．ThemtDNAobtainedinthiswaycouldbeusedasmtDNAwithoutcontaminationofnuclearDNA．Keywords：Wheat；MitochondrialDNA；Internalreferencemethod；Identificationofpurity线粒体是位于细胞质中的细胞器，主要功能是进行呼吸代谢，为细胞提供能量，被称为细胞的“能量工厂蛐]。线粒体是半自主型细胞器，具有自身的遗传物质，线粒体蛋白由mtDNA和细胞核DNA共同编码Ⅲ。目前，线粒体的遗传表达已成为研究植物雄性不育机理的热点领域‘3。6。

7、。许多研究结果显示，植物界普遍存在的雄性不育与线粒体正常呼吸代谢受阻有关‘7‘。当前，植物mtDNA的提取方法主要有：密度梯度离心法嘲和普通的差速离心法‘9。10]。密度梯度离心法提取的mtDNA纯度较收稿日期：2009—06—12修回日期：2009—08—04基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)重大专项(No．2009AAl01102)；陕西省“13115”科技创新工程霞大科技专项(No．2007ZI)KG一