real-time pcr(从原理到实验方法及数据分析)

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1、Real-timePCRXiaoJinAppliedSpecialistMolecular&CellularBiologyReal-timePCR原理数学原理化学原理Real-timePCR应用绝对定量相对定量等位基因分型阴阳性判定microRNA荧光定量PCR数学原理基线阈值Ct值[DNA]0由于PCR扩增效率的差异使得相同的样品扩增结果存在很大的差异同时扩增96的相同样品的结果扩增曲线：四个阶段线性图谱对数图谱平台期线性增长期指数增长期基线期平台期线性增长期指数增长期基线期基线阈值Ct值[DNA]0什么是

2、基线？基线就是扩增曲线中的水平部分。线性图谱对数图谱基线阈值Ct值[DNA]0什么是阈值？1.基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。2.偶然误差的结果满足对数分布。3.阈值=基线（背景）信号标准偏差x10。4.由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈值的概率小于10－5。5.当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光强度得以测量。基线阈值Ct值[DNA]0什么是C值？T从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数线性图谱对数图谱CT值CT值为什么C值∝[DNA]？T0nN：产物分子数；

3、N：起始分子数N=Nx(1+e)00e：扩增效率；n:循环次数PCR理论方程只在指数期成立线性期lg[DNA]y=x(1+e)n指数期循环数为什么C值∝[DNA]？T0R=R+X(1+e)nRnB0s第n次PCR循环时的荧光信号强度(R)等于背景信号强度(R)加上每个分nB子的荧光强度(即单位荧光强度，R)与分子数目的乘积。S设n=C，则：R=R+X(1+e)CTRTCTB0slg(R-R)=lgX+Clg(1+e)+lgRCTB0TsClg(1+e)=-lgX+lg(R-R)–lgRT0CTBslogXlo

4、g(R−R)−logROTBSC=−+Tlog(1+E)log(1+E)XX即C=-klgX+b（线性方程）T0标准曲线：C值对[DNA]作图T0C值TC=-klgX+bT0lg[起始DNA]成功的定量PCR荧光定量PCR化学原理SYBRGreenI作用机理数量关系1.每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去2.染料一结合，就产生荧光信号3.信号强度与DNA分子总数目成正比TaqMan探针的FRETEETaqMan®ProbeRQEERQTaqMan作用机理数量关系TaqMan探针上游引物RQ3’5’

5、5’3’下游引物RQ3’5’5’3’1.每产生一条DNA链，就切断一条探针2.每切断一条探针，就产生一个单位信号3.信号强度与结合探针的DNA分子数成正比Real-timePCR应用•绝对定量(AbsoluteQuantification，AQ)•病原体检测•转基因食品检测•基因表达研究•相对定量(RelativeQuantification，RQ)•基因在不同组织中的表达差异•药物疗效考核•耐药性研究•等位基因分型(AllelicDiscrimination，AD)•基因突变分析•SNP研究•物种鉴定、菌株

6、鉴定•阴性阳性鉴定(Plus/MinuswithIPC，+/-)实时实时PCRPCR分析分析绝对定量绝对定量相对定量相对定量根据标准曲线提供精确的起始材料提供数量测量相对数量差异绝对定量与相对定量的定义•绝对定量分析用于确定未知样本中某个核酸序列的绝对量值，即通常所说的拷贝数。•相对定量用于测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序列表达的相对变化。校正样本可以是一个未经处理的对照或者是在一个时程研究中处于零时的样本。绝对定量：从荧光到拷贝数Thewellcontains400targetcopiesY

7、=mx+bCt‘sCtvalues01234567Logcopynumber相对定量：参照因子Calibrator用以比较结果的基准timet=0t=12t=24t=48totalRNAtotalRNAtotalRNAtotalRNAcDNAcDNAcDNAcDNA相对定量：内对照EndogenousControl用以标准化样品操作timet=0t=12t=24t=48totalRNAtotalRNAtotalRNAtotalRNAcDNAcDNAcDNAcDNAIL-218SΔCΔΔC2-ΔΔCtttT=0

8、(calibrator)2491501.0T=1hr241014-12.0T=6hr231112-38.0T=24hr28101830.1108.08t=06t=1h42.0t=6h210.1t=24hRelativeQuantityofExpression0相对定量研究软件•同时分析多达10块反应板的基因表达数据–多至960个数据点的单击分析–数据直观•通过ΔΔCT(比较Ct)法完全自动分析数据•