《生物化学实验指导》PPT课件

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1、生物化学实验指导课件天水师范学院生物系二OO二年二月前言随着生物化学的发展和生物化学教学内容的不断丰富。生物化学实验也在不断更新和提高。1992年，我们编写了一本《生物化学实验指导》作为专科生实验教材，并在实验教学的过程中不断修改并加以充实。这次编写的生物化学实验指导是在以往工作的基础上，结合生物化学实验教学改革、作为本、专科生物化学实验教改项目的一个重要内容。在这次编写过程中，我们确立了这样一个指导思想⑴去掉了许多定性和验证性实验，加大了定量分析的内容；⑵在同一项目实验中，同时介绍了不止一种方法和技

2、术⑶增加了部分大实验，力求使学生有一个完整的实验训练过程，有利于培养学生实验设计能力、分析问题能力和独立操作能力，以达到知识、能力和素质的全面提高。本实验指导共计十五个实验，分基础实验、提高实验、高级实验三篇，内容覆盖了当今生物化学研究中常用的方法与技术。生物化学实验指导实验一蛋白质的沉淀、变性反应实验二蛋白质的等电点测定(pH法)实验三酶的特性实验四菜花(花椰菜)中核酸的分离和鉴定基础实验实验一3，5—二硝基水杨酸比色定糖法实验二Fo1in—酚法测定血清蛋白质含量实验三血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验四

3、蛋白质分子量测定（葡聚糖凝胶薄层层析法）实验五脂肪酸的β-氧化实验六核酸浓度测定—定磷法实验七血液中转氨酶活力的测定(分光光度法)实验八维生素C的定量测定提高实验实验一酯酶的分离、纯化与活性测定实验二酯酶同功酶的垂直板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分析实验三底物浓度对酶促反应速度的影响（米氏常数的测定）高级实验注意事项返回实验器材、药品实验原理实验操作酯酶的分离、纯化与活性测定酯酶是A—酯酶，B—酯酶和胆碱酯酶的总称，它与人体有机磷药物中毒机制有关。本实验利用离子交换层析法分离和纯化酯酶，常用的阳离子交换剂

4、有弱酸性的羧甲基纤维素(CM—纤维素)，阴离子交换剂有弱碱性的二乙氨基乙基纤维素(DEAE—纤维素).蛋白质的混合物与纤维素离子交换剂的酸性基团或碱性基团相结合，结合力的大小取决于彼此间相反电荷基团的静电引力，这又与溶液的pH有关，因为pH决定离子交换剂和蛋白质的解离程度。盐类的存在可以降低离子交换剂的解离基团与蛋白质的相反电荷基团之间的静电引力。因此，被吸附的蛋白质的洗脱通过改变pH或离子强度(或二者同时改变)来实现；与离子交换剂结合力小的蛋白质首先从层析柱中被洗脱下来。本实验采用CM—纤维素离子交

5、换剂，通过柱层析，经梯度洗脱从鼠肾丙酮粉抽提液中分离、纯化酯酶。梯度洗脱法是在洗脱过程中，使洗脱液的pH或盐浓度(或两者同时)发生连续的梯度变化，从而使吸附在柱上的各组分在不同的梯度下洗脱下来。本实验采用的是盐离子浓度梯度洗脱法，其装置由两个彼此相连的容器组成，在与层析柱相连接的一个容器(混合瓶)中，放入梯度洗脱开始时所需浓度的盐溶液(低浓度)，并配有搅拌装置，另一容器(贮液瓶)中放入高浓度的盐溶液，其浓度即梯度洗脱最后所需的浓度。两个容器的底部必须保持水平，液面的高度也应该相同。这样，当两容器之间的

6、通道打开，并使混合瓶溶液流进层析柱时，梯度即开始形成。由于这两个容器是连通的，当混合瓶的溶液开始流入层析柱，它的液面高度就逐渐下降，为了维持两容器的液面高度的一致，高浓度的盐溶液即从导管流入混合瓶，结果混合瓶中溶液的盐浓度呈梯度上升。原理返回返回操作一粗酶制剂的制备二CM—纤维素离子交换剂的处理三层析柱的安装和平衡四加样和梯度洗脱五酯酶活性的测定六结果处理返回流程图结果处理酯酶活性测定梯度洗脱上样组合层析装置层析柱安装层析介质处理粗酶制剂制备一、粗酶制剂的制备杀死大白鼠，迅速剖腹取肾，置于冰浴中剔除脂

7、肪和结缔组织。新鲜肾组织和—15℃丙酮，按10g重量和100m1容积的比例，一同置入Waring捣碎器中捣碎，为避免温度升高，捣碎0.5min后，把匀浆倒入烧杯中，置于冰盐浴冷至—15℃，再捣碎0.5min，反复3次。然后把匀浆倾人布氏漏斗抽滤，用—15℃丙酮洗涤3次，按上述方法再捣碎滤饼，抽滤和洗涤一次。将最后得到的滤饼散置于表面皿，放入真空干燥器干燥数天，即得丙酮粉干品，每10g新鲜肾组织可制得丙酮粉3—4g。按100mg丙酮粉加入5m11×10—2mo1／lpH6.0磷酸缓冲液的比例，将二者放入

8、烧杯中，置于冰箱内抽提30min，不时搅拌。抽提液在3000r／min下离心10min，上清液即为粗酶制剂(保存于冰箱待用)。测定此粗酶制剂的蛋白含量(按Fo1in—酚试剂法)和酶活性。返回二、CM—纤维素离子交换剂的处理称10gCM—纤维素干品置于烧杯中，加入100ml0.5mol／lNaOH—0.5mol从NaCl溶液，混匀，静置15min后，在布氏漏斗中抽滤，水洗滤饼至中性。此滤饼再悬浮于100m11mo1／lHCl溶液中，混匀，静置10min后放