《物理图绘制》PPT课件

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1、第三章物理图绘制学习要点：物理作图的方法各种方法的优缺点用遗传学技术作图对于指导基因组计划的测序阶段还是远远不够的，因为遗传图谱的局限性：遗传图的分辨率有限：依赖于所得到的交换数目。遗传图的精确性较低：重组热点的存在。遗传图的准确率有限：环境因素和取样误差，分子标记的排列有时会出现差错。物理图谱是以物理距离来表示各遗传标记之间或DNA序列两点之间在DNA分子上的位置，以实际的碱基对长度来度量其物理距离。1）限制性作图（Restrictionmapping）：它是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置。2）依靠克隆的

2、基因组作图(Clone-basedmapping)：根据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群(Contig),绘制物理连锁图。3）荧光原位杂交（Fluorescentinsituhybridization,FISH）：将荧光标记的探针与染色体杂交确定分子标记的所在位置。4）序列标记位点作图（Sequencetaggedsite,STS）：通过PCR或分子杂交将小段DNA序列定位在基因组的DNA区段中。物理图绘制方法3.1限制性作图3.1.1限制性作图---小分子DNA在连续出现2个或多个相同酶切位点区段，其排列序列

3、可有多种选择，此时采用部分酶切的办法使该区段只发生一次酶切，这称为部分限制作图。部分限制作图为构建完整的图谱提供了必须的信息。但如果有多个限制位点，这种方法就显得力不从心。特别是内部含有大小相同的片段时，重叠的片段无法区分，使排序变得非常复杂。一个较简单的变通策略使我们可以忽略大量的片段。这种方法是将标记物加到要分析的DNA分子两端，进行部分酶切处理后，很多产物成为不可见的，我们利用可见的部分大小，确定那些未定位的切点与DNA分子末端的相对位置。1)制备---琼脂糖包埋法2)酶切---稀有酶切位点限制酶3)分离---脉

4、冲电泳分离3.1.2限制性作图的局限如果基因组较大，切点较多，单、双、部分酶切的片段会很多。限制性作图只能应用于较小的DNA分子。大分子DNA的研究策略与方法：1.制备--琼脂糖包埋法1)分离纯化细胞核；2)将收集的细胞核包埋在琼脂糖凝胶薄片中；3)蛋白酶消化处理细胞核。2.稀有切点限制性内切酶的应用1)稀有切点限制酶：在基因组DNA序列中只有很少可识别序列的限制酶，一般识别位点在6-8碱基对之间,并含有高G/C比。2)选用稀有切点限制酶注意事项：a)识别位点的非特异序列，-GANTC-(HinfI)，-GCCN4NG

5、CC-(BglI)b)高等生物基因组一般A/T比较高，应选G/C高比例限制酶，如-GCGGCCGC-(NotI)c)基因组甲基化状态，人类基因组DNA中5’-CG-3’的序列较少。稀有切点限制酶常规与非常规琼脂糖凝胶电泳正交变电场凝胶电泳3.脉冲凝胶电泳均一脉冲电泳3.2基于克隆的基因组作图---大分子DNA的克隆基于克隆的基因组作图：根据克隆的DNA片段之间的重叠序列构建重叠群(Contig)，绘制物理连锁图。3.2.1克隆作图的载体和方法常规的质粒载体不适用于大分子DNA的克隆。大分子DNA克隆载体构建:YAC,B

6、AC,HAC,MAC酵母人工染色体（YAC）端粒：用于保护线状的DNA不被细胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。着丝粒：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在YAC中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。自主复制序列：一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA进行双向复制所必须的信号。YAC文库装载的DNA片段的大小一般可达200-500kb，有的可达1Mb以上。YAC载体的工作原理YAC的主要缺点：1．存在高比例的嵌合体，即一个YAC克隆含有两个本来不相连的独立片段；2

7、．部分克隆子不稳定，在转代培养中可能会发生缺失或重排；3．难与酵母染色体区分开，因为YAC与酵母染色体具有相似的结构;4．转化效率低。细菌人工染色体（BAC）：以细菌F因子为基础，人工构建的环状的DNA分子。可以携带大于100-350Kb的外源DNA片段。选择标记：氯霉素抗性基因等。BAC载体的优点：较为稳定；没有嵌合现象；转化效率高；BAC克隆易于操作和DNA提取；BAC文库筛选方便。基因组文库：指将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机的同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了某种

8、有机体整个基因组。1)目标基因组大分子DNA的制备；2)载体制备；3)载体和DNA的连接；4)转化；5)转化子鉴定。YAC和BAC基因组文库的构建目标基因组大分子DNA的制备样品→洗涤吸干水分→液氮冷冻→碾碎→离心收集细胞核→低融点琼脂糖包埋→蛋白酶消化→洗涤→限制酶部分酶解插入大分子DNA的分离载体制备与插入DNA连接1)YAC