《核酸电泳》课件

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1、核酸物质提取与电泳天然DNA的制备总DNA：主要指基因组DNA(genomicDNA)，即细胞核内的染色体DNA分子。如果将螺旋状的DNA分子拉直，其长度将超过人的身高，这个特点使其对机械力十分敏感。目前可以成功地测出它的一级结构，但仍难以分离出它的完整分子。特点：一条染色体为一个DNA分子，高等生物核DNA的长度与直径的比值很大，DNA分子呈极不对称的线状结构．1.天然DNA的来源(1)染色体DNA(2)病毒与噬菌体(3)质粒DNA(4)线粒体与叶绿体2.DNA的提取细胞的破碎物理方式：超声波法、匀浆法、液氮破碎法、煮沸破碎法、微波破碎法等；特点：容易导致DNA链的断裂.酶解法：蛋

2、白酶K裂解法（常和SDSCTAB法一起裂解细胞）、溶菌酶裂解法（常和热处理一起裂解细胞）等；化学法：CTAB裂解法、SDS裂解法等等；特点：简单易行；能满足分子生物学研究的需要。超生波液氮总DNA的提取：去除多糖、脂类、蛋白等，添加Rnase降解RNA后得到的就是DNA去除多糖：CTAB、PVP、高盐溶液等去除脂类：SDS、CTAB等去除蛋白：SDS、蛋白酶Ｋ、酚／氯仿等质粒DNA的提取破坏细胞壁溶菌酶、强碱和十二烷基磺酸钠(SDS)裂解细胞膜十二烷基磺酸钠(SDS)、TritonX-1001、蛋白质及其它杂质的去除SDS使蛋白形成不溶物，沉淀出来高浓度盐离子(KCl)使变性蛋白、

3、多糖、细胞碎屑等沉淀出来2、细菌线形染色体DNA的去除强热、碱处理时，细菌线性染色体DNA变性，当快速降温、加入酸中和时，已变性的细菌线性染色体DNA变性不能快速复性，与其它杂质缠绕而沉淀出来质粒DNA双链可快速恢复原状,重新形成超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中3.DNA的纯化和浓缩(1)乙醇(2)异丙醇(3)聚乙二醇(PEG600)工作区域应与普通微生物实验的区域隔开！RNA的提取分离1.应与进行普通微生物实验的区域分离开2.使用标有“无RNA酶”的商品试管,吸头,溶液和水.（通常新的无菌处理过的塑料试管和吸管无RNA酶）3.双蒸水(ddH2O)和溶液应该用RNA酶的抑制剂DE

4、PC(焦碳酸二乙酯)进行处理:a、每100mL溶液或水中加入0.1mLDEPC原液,放在摇床上充分混匀并在37℃下作用数小时.b、将溶液高压灭菌至少15min使DEPC失活4.分离RNA以前,将一些实验室玻璃制品置于烤箱在300℃烘烤至少4h以灭活核酶.如有可能,将其他设备也灭菌处理前期准备:1.在Trizol试剂的保护下，匀浆组织，静置裂解细胞释放内含RNA，Trizol试剂对RNA有保护作用，能抑制RNA酶的活性，并且同时有裂解细胞的作用。2.将匀浆液中加入苯酚，去除裂解液中的脂类，蛋白和DNA，离心后取出上清液，里面含有RNA，而杂质留在苯酚中3.在上清液中加入等体积异丙醇，混

5、匀后，静置片刻，离心，将RNA沉淀于管底。弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀，离心。去上清，将沉淀在真空干燥器中烘干RNA提取关键步骤核酸电泳NucleicAcidGelElectrophoresis正极负极带负电粒子带正电粒子电泳(electrophoresis)：带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。许多重要的生物分子如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都含有可电离基团，在非等电点条件下均带有电荷。凝胶电泳的原理：电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度。（当一种分于被放置在电场当中时、它们就会以一定的速度移向适当的电极）。1、同电场的强度和电泳分子本身所携带

6、的净电荷数成正比。（电场强度越大电泳分子所携带的净电荷数量越多，迁移的速度越快。反之则较慢）2、电泳的迁移率与分子的摩擦系数成反比。电泳时会使用一种无反应活性的、稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等，降低了对流运动。数据表明：摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数．电泳的原理：根据分子大小的不同、构型或形状的差异以及所带净电荷的多寡，可以通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。19世纪初(1808)发现了电泳现象。当时多用于胶体化学的分析1937年Tiselius利用U形玻管进行血清蛋白电泳，以界面折光率差别分离蛋白呈4-5高峰即界面电泳1948年Wiel

7、and等发明以滤纸作为支持物，使电泳技术大为简化近30年来，由于采用多种新型支持物，仪器装置亦得到不断改进，因此出现了许多新型的电泳技术（一）电泳的分类：1、按分离原理分为：自由电泳如：显微电泳区带电泳稳态电泳（置换电泳）：如等电聚焦和等速电泳特点：分子颗粒的电泳迁移在一定时间后达到稳态自由界面电泳非自由界面电泳自由电泳由于设备复杂，操作时间很长，不能完全地分离混合物的各个组成等一些不可克服的缺点，已逐渐为区带电泳所代替检测微粒电荷的符号、数量及电泳率，能