《核酸电泳》PPT课件

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1、核酸物质提取与电泳天然DNA的制备一般地说。总DNA主要是指基因组DNA(genomicDNA)，即细胞核内的染色体DNA分子。核DNA分子呈极不对称的线状结构．一条染色体为一个DNA分子。高等植物核DNA大约含有106bp,其长度与直径的比例极不对称．使其对机械力十分敏感。虽然目前可以成功地测定出它的一级结构。但仍难以分离出它的完整分子。1.天然DNA的来源(1)染色体DNA(2)病毒与噬菌体(3)质粒DNA(4)线粒体与叶绿体2.DNA的提取细胞的破碎破碎的手段：物理方式：超声波法、匀浆法、液氮破碎法:容易导致DNA链的断裂.对于细胞破

2、碎较困难的植物材料，可以辅加蛋白酶K，在酶的存在下共同破碎细胞。超生波液氮总DNA的提取方法：去除多糖、脂类、蛋白等，得到的就是核酸去除多糖：CTAB、PVP、高盐溶液等去除脂类：SDS、CTAB等去除蛋白：SDS、蛋白酶Ｋ、酚／氯仿等DNARNA质粒DNA的提取破坏细胞壁溶菌酶、强碱和十二烷基磺酸钠(SDS)裂解细胞膜十二烷基磺酸钠(SDS)、TritonX-100蛋白质及其它杂质的去除SDS使蛋白形成不溶物，沉淀出来高浓度盐离子(KCl)使变性蛋白、多糖、细胞碎屑等沉淀出来细菌线形染色体DNA的去除强热、碱处理时，细菌线性染色体DNA变

3、性，当快速降温、加入酸中和时，已变性的细菌线性染色体DNA变性不能快速复性，与其它杂质缠绕而沉淀出来质粒DNA双链可快速恢复原状,重新形成超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。3.DNA的浓缩(1)乙醇(2)异丙醇(3)聚乙二醇(PEG600)工作区域应与进行普通微生物实验的区域分离好RNA的提取分离RNA提取的通用方法异硫氰酸胍/苯酚法原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到

4、纯净RNA。异硫氰酸胍/苯酚法步骤:材料准备：尽量新鲜。裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。洗涤：70％乙醇。沉淀：异丙醇、无水乙醇。乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。RNA提取的通用方法影响RNA提取的因素材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于－70℃或－2

5、0℃保存如要多次提取，请分成多份保存液氮长期保存，－70℃短期保存影响RNA提取的因素样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如LiCl沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成RNA降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，

6、能有效去除影响RNA后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。影响RNA提取的因素RNA提取常见问题RNA的降解OD260/OD280比值偏低电泳带型异常下游实验效果不佳RNA降解新鲜细胞或组织：裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免RNA的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。RNA降解冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具

7、必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。OD260/OD280比值偏低蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚残留：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。OD260/OD280比值偏低抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮RNA，并且彻底去掉75%乙醇。解决办法:再沉淀一次后，溶解。设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.

8、10-0.50之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD时，对照及样品稀释液请使用10mMTris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值的降低。电泳带型异常非变性电泳：上样量超过