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1、拟南芥组织培养一、种子消毒：方法一：将拟南芥种子置于1.5mleppendorf管(微量离心管)中，加入1ml蒸馏水，4C春化3d，70%（v／v）乙醇1min、7%（v／v）次氯酸钠10min浸泡消毒，并用无菌水冲洗5次。方法二：在超净工作台内，用无菌蒸馏水浸泡1min，然后用80％乙醇消毒90s，最后用无菌蒸馏水冲洗3～5次备用。消毒完毕的种子可以用200ul的tips吸去洗涤液，然后在超净工作台上挥发掉残余水分、洗涤液。方法三、取野生型拟南芥种子放人离心管内，75％乙醇清洗后，无菌蒸馏水清洗1—2次，转入无菌离心管；5％次氯酸钠
2、溶液浸泡5—6min，用无菌蒸馏水清洗3～4次，加入1ml无菌水，用移液枪接种。二、选用的培养基选用1/2MS培养基对种子进行培养。（MS和1/2MS都可以，1/2MS就是大量元素减半，其他东西和ms培养基是一样的量。糖可以加，会长得比较好，但是也很容易污染。如果在平板上要生长时间比较长，需要做一些实验的，比如根的发育，最好不要加。）也可以用MS+30g／L蔗糖的固体培养基。（我想两种培养基都接种上，比作对比确定好坏）。MS培养基配料表：三：接种方法拟南芥种子消毒后，用移液枪吸取拟南芥种子和水的混合物，均匀地在MS生长培养基的培养皿平
3、板上滴落，并使之形成两条平行的直线。（如不行，可适当添加琼脂）。四、培养得无菌苗接种后置于光照培养箱(型号：GXZ．500C；培养光照条件为16小时光照，8小时黑暗，培养温度为22℃中竖直培养。3天后即可取材用于器官离体再生实验。萌发5天后，在超净工作台中，用镊子将苗移栽到装有1／2MS培养基的50ml三角瓶中（每瓶4--6棵，视情况而定），于短日照条件下培养30天左右获得无菌苗。（短日照光照条件8小时光照，16小时黑暗，长日照光照条件为16小时光照，8小时黑暗，培养温度均为22℃。）此处获得无菌苗的时间有异议，应该为2--3周？五、
4、外植体的选取B5+5mg／L2，4-D+0.5mg／LKT培养基上诱导愈伤组织,莲座叶作外植体出愈慢，出愈率低，愈伤组织质量较差；叶柄、下胚轴和根作外植体出愈快，且愈伤组织质量好，后期易分化。由于叶柄、下胚轴相对较短，难于收集，为了便于操作，减少污染，试验中采用根作为外植体诱导愈伤组织和诱导分化试验。所取外植体的大小为5mm左右，不宜过大或过小。滴落种子形成的两条直线位于平皿的上半部，可以避免伸长的根被培养基中渗出的水分所淹。无菌苗的苗龄太短不易得到足够多的外植体，苗龄太长则外植体脱分化的时间明显延长，最适苗龄以2--3周为宜。六、胚
5、性和非胚性愈伤组织的诱导1、以MS为诱导培养基,附加2,4一D2mg/L,KT、NAA各0.5mg/L,水解酪蛋白300mg/L，6%蔗糖，0.7琼脂，PH5.82、接种幼穗长度为1--2cm左右,置于28℃恒温箱内暗培养。形态鉴定：幼穗接种后,一星期左右开始长出愈伤组织。将其置于解剖镜下观察可以发现两种不同类型的愈伤组织。一类质地紧密,有光泽,乳白色或浅黄色,愈伤组织表面有许多光滑的球形突起,呈颗粒状。每个球状体用镊子很易从愈伤组织上分离下来。这种愈伤组织被认为是胚性愈伤组织。另一类质地疏松且湿软,常伴有粘液物质,没有光泽,黄色至褐
6、色,此类愈伤组织没有一定的形态结构。（栽培稻）NB培养基可明显提高拟南芥的愈伤组织出愈率，且以NB培养基为基础配以2，4一D2．0mg／L和6一BA1．0mg／L时，拟南芥的愈伤组织生长状态最好。MS+2,4?D0.5mg/L+6?BA0.3mg/L,诱导率达87.5%,且愈伤组织生长较好。培养基中添加5g/L活性炭能有效地抑制外植体褐化。MS培养基对籼稻种胚愈伤的诱导培养效果较好,NB培养基则更适合粳稻种胚愈伤的诱导培养。诱导继代培养基为NB(N6培养基的大量元素,B5培养基的微量元素和有机物)、MS和LS基本培养基,辅加2,4-D
7、(2.5mg/L),6-BA(0.5mg/L),30g/L蔗糖,10g/L琼脂或3g/L植物胶。BA对于愈伤组织诱导不可缺少，但其浓度太高易产生玻璃化；NAA单独使用利于生根，配合6一BA使用利于分化芽；获得最适愈伤组织诱导培养基为Ms+O．50mg／L6-BA+0．10me,／LNAA，愈伤组织诱导率可达100％。NB培养基用途：用于植物组织培养配方：（mg/L）硝酸钾(KNO3)硫酸铵((NH4)2SO4)氯化钙(CaCl2·2H2O)磷酸二氢钾(KH2PO4)硫酸镁(MgSO4·7H2O)硼酸(H3BO3)硫酸锰(MnSO4·4
8、H2O)硫酸锌(ZnSO4·7H2O)钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)硫酸铜(CuSO4·5H2O)氯化钴(CoCl2·6H2O)碘化钾(KI)乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA)硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)肌醇(
