《微生物实验技术》PPT课件

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1、微生物实验技术（一）一、显微镜技术光学显微镜技术普通光学显微镜技术相差显微镜技术荧光显微镜技术电子显微镜技术1.普通光学显微镜技术（lightmicroscopy）结构光学放大系统：物镜（油镜、高倍镜和低倍镜）和目镜（10×、16×）照明系统：光源、反光镜和聚光器机械和支架系统分辨率分辨率：指区分开两个质点间的最小距离。D=0.61λ/(n·sinθ)D：分辨率λ：波长n：物镜与物体间介质折射率2θ：物镜镜口角N.A：即n·sinθ，数值孔径2θ最大值=140℃，空气中n=1，最短的可见光波长λ=450nm，分辨率D=292nm，约0.3um油镜：n=

2、1.52，D=0.2um普通光镜的最大分辨率D=0.2um2.相差显微镜技术（phase-contrastmicroscopy）相差显微镜与普通显微镜的区别：在物镜后装有一块“相差板”，偏转的光线分别通过相差板的不同区域，由于相差板上部分区域有吸光物质，使两组光线之间增添了新的光程差，从而对样品不同密度造成的相位差起“夸大”作用。最后这两组光线经过透镜又会聚成一束，发生互相叠加或抵消的干涉现象，表现出肉眼可见的明暗区别。相差显微镜将光程差或相位差转换为振幅差，即明暗差别。相差显微镜的样品不需染色，可以观察活细胞及细胞内的某些细微结构。光线通过不同密度的

3、物质时，其滞留程度也不同，密度大则光的滞留时间长，密度小则滞留时间短。3.荧光显微镜技术(fluorescencemicroscopy)仪器：点光源（高压汞灯），滤色系统原理：荧光物质，激发光，发射光利用一个高发光效率的点光源（高压汞灯），以最小表面释放出最大数量的紫外光（365nm）和蓝紫光（420nm），经过滤色系统，作为激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜（石英玻璃制成）的放大进行观察，这种荧光在显微镜下很容易辨认，敏感性高，能对细胞的特定物质进行定性、定位和定量观察。荧光：自发荧光：通过激发光使物体发出荧光，

4、如叶绿素、维生素A诱发荧光：通过诱导剂作用而发出的荧光，如甲醛蒸汽处理诱发细胞和组织中生物单胺类产生荧光荧光染料染色荧光：丫啶橙对细胞DNA、RNA同时染色后，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙色荧光。4.电子显微镜技术（electronmicroscopy）原理：使用波长比可见光短得多的电子束作为光源（波长一般小于0.1nm），用电磁透镜聚焦，电镜镜筒中要求高真空，图象需用荧光屏来显示或感光胶片作记录。分辨率：0.2nm；放大倍数106倍。人眼分辨率0.2mm；光学显微镜分辨率0.2um，放大倍数1000倍。基本构造电子束照明系统：电子枪、聚光镜成像系统

5、：物镜、中间镜、投影镜真空系统：用两级真空泵抽气，保持电子枪、镜筒及记录系统内的高真空。记录系统：用荧光屏显示或感光胶片作记录。电子显微镜与普通光学显微镜的基本区别分辨本领光源透镜真空成像系统光学显微镜200nm可见光玻璃透镜不要求利用样品对光的吸收形(λ:400-700nm)成明暗反差和颜色变化100nm紫外光玻璃透镜不要求(λ约200nm)电子显微镜约0.1nm电子束电磁透镜1.33×10-5~利用样品对电子的散(λ:0.01~0.9nm)1.33×10-3Pa射和透射形成明暗反差超薄切片技术固定--脱水--包埋--切片--染色固定：要求保持样品的

6、形态结构不发生改变，常用固定剂为戊二醛和锇酸等，通常在低温下固定。包埋：使样品中各种细微结构在切片过程中都得到均匀良好的支撑，使切成的超薄切片仍能保持连续完整并且有足够的强度，并能耐受干燥以及观察时的电子轰击、高温和真空挥发。常用的包埋剂为环氧树脂。包埋剂多与水不相溶，所以包埋前要经过一系列脱水处理。切片：厚度通常为40~50nm，常用玻璃刀。染色：用重金属盐进行染色以形成明暗反差。样品中不同成分对染料有不同亲和性（脂肪：锇酸；蛋白质：铅盐；核酸：醋酸铀）冷冻蚀刻技术方法冷冻—快速低温冷冻法将样品在液氮或液氦中迅速冷冻断裂—低温下断裂蚀刻：在真空中冰升

7、华复型用铂、金等金属进行倾斜喷镀，以形成对应于凹凸的电子反差，再经碳垂直于断面进行真空喷镀，形成一个连续的碳膜，然后用消化液把样品本身消化掉，将剩下的碳膜及其构成图形的金属微粒移到载网上进行电镜观察。冷冻蚀刻技术主要用来观察断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构，样品不需包埋、固定，能更好地保持样品的真实结构。负染色技术负染色：利用电子密度比标本高的重金属盐（如磷钨酸钠、醋酸钠等）将生物标本包围起来，增强背景散射电子的能力以提高反差，在暗的背景下显示标本的形态结构。主要用于颗粒状标本（细菌、病毒、分离的细胞器等）的研究。二、常用的微生物染色法简单染色法革兰氏染

8、色法负染色法细菌的观察方法水浸片（压滴法）：在载玻片中央滴一滴无菌水，再在其中加入少许菌体，使