FISH技术在血液疾病诊断中的应用x

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1、荧光原位杂交（FISH）技术——血液肿瘤诊疗中的应用一、技术二、质控三、临床应用四、多技术结合应用案例技术理论1950-19601960-19701970-19801980-1990显带时期非显带时期1888提出染色体1914染色体畸变导致肿瘤1956确定染色体46条1958应用于血液学1960发现Ph染色体CML显带技术高速发展G/R多种血液病相关异常核型被发现FISH中期/间期多色FISH微阵列技术aCGH、aSNPCGH技术分子遗传细胞遗传学发展简史FISH技术的发展1990年FISH1992年CGH1996年24色FISH（SKY、M-FISH、RX-FISH）2

2、001年arrayCGH技术原理AGGCTATTCCGATACOVALENTBONDFFSpecimenDNAFISHProbeDNA操作步骤FISH样本的制备（染色体制备、细胞滴片制备）探针制备（体系：杂交缓冲液、蒸馏水、探针）探针标记杂交（76℃变性10min、37℃杂交10h）洗脱DAPIⅡ复染荧光显微镜检测结果分析FISH技术的特点•操作简便，稳定，人员培训较快•方法敏感，特异性好，检测效率高，能迅速得到结果，24小时就可以完成检测•标本来源丰富，细胞不需培养，间期细胞，分裂中期细胞、分化或未分化细胞及死亡或存活的细胞皆可以被检测•可与多种技术结合（细胞形态学、免

3、疫学、流式细胞术），可回顾性分析,可确定恶性细胞的克隆起源或鉴别良恶性细胞FISH技术的局限性异常检测取决于能否获得相应探针三体检测敏感性高于单体或缺失骨髓、外周血标本较实体瘤、石蜡切片好处理不能检测全基因组异常（间期FISH）FISH主要仪器FISH分析工作站（荧光显微镜、分析照相软件）荧光原位杂交仪恒温水浴槽高速离心机培养箱微量加样器pH仪FISH技术比较FISHSKYM-FISHRX-FISHCGHaCGH全染色体扫描×√√√√平衡易位√√部分××不平衡易位√√部分√√倒位√×部分××缺失√×部分√√扩增√部分√√√非整倍体√√√××分辨率1-1

4、0kb2-10Mb2-10Mb3Mb10-100kbFISH探针种类着丝粒探针位点探针涂染探针双色单融合探针额外信号探针双色双融合探针正常异常双色分离探针数量、位点探针人类细胞遗传学命名nucish(CEP8×2)[400]nucish(BCR,ABL)×2[400]nucish(BCR,ABL)×3,(BCRconABL×2)[380/400]nucish(MLL×2)[400]nucish(MLL×2)(5’MLLsep3’MLL×1)[100/200]nucish(CEPX×2)[2]//(CEPX,CEPY)×1[398]A:nucish(ABL,BCR)×

5、2B:nucish(ABL×2,BCR×3)ABLBCRAABLBCRBA:nucish(ABL,BCR)×3(ABLconBCR×2)B:nucish(ABL,BCR)×4(ABLconBCR×3)C:nucish(ABL×3,BCR×2)(ABLconBCR×1)ABLBCRBBCRABLACABLBCRTELAML1A:nucish(TEL×2,AML1×3)(TELconAML1×1)B:nucish(TEL×1,AML1×4)(TELconAML1×1)C:nucish(TEL×2,AML1×5)AML1TEL/AML1AAML1TELBCABCD5S721D5

6、S721D5S721EGR1EGR1EGR1A:nucish(D5S23/D5S721×1,EGR1×1)B:nucish(D5S23/D5S721×2,EGR1×1)C:nucish(D5S23/D5S721×3,EGR1×1)质量控制质量管理内容商品探针、自配试剂验证标准化流程及规范化操作（前处理、实验操作）规范判读标准建立本实验室判读阈值建立临床生物参考区间FISH操作流程•样本制备：细胞、骨髓、外周血、组织等•制片：细胞悬液滴片或石蜡组织切片•预处理：2×SSC，固定液，NaSCN•酶消化：胃蛋白酶，蛋白酶K•变性：温度•杂交：互补结合，温度•洗涤：无附

7、离子溶液，PH，温度复染：DAPIII•读片：荧光显微镜，滤镜FISH技术要点样本浓度、切片厚度、细胞状态充分低渗与固定制片环境温度与湿度探针充分混匀变性液pH与温度橡皮泥严密封片洗脱液温度抗衰变剂规范判读•规范正常和异常信号•杂交成功率>75%•计数数量、方法：•单人，分别于不同区域各连续计数200个细胞•双人，每人于不同区域各计数200个细胞计数规范信号判读误差分离信号误判石蜡切片误差建立阈值选取正常样本10-20份建立针对探针的假阳性率统计方法•x+3SD•β分布（95%可信区间）结合临床逐步建立