fish技术与其在环境微生物中的应用

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1、哈余读师范大学学年论丈题目FISH技术及其在环境微生物中的应用学生李晓晶指导教师王继华教授年级2009级专业生物科学系别生物学系学院生命科学与技术学院哈余滨岬范大学2012年4月论文提要荧光原位杂交与微量自动照相集成技术(FISH)能够同时在单细胞水平原位进行细胞的分类鉴定与细胞对底物的吸收特性研究,这是微生物学研究领域的一大突破。目前，这一技术已有效应用于工程系统(污水处理厂、生物反应器等)与自然生态系统中微生物的研究。污染水体的原位强化净化及其生态修复与微生物也有着密切的关系，因此，这一技术的应用不仅能够提高工程系统污水处理效率，也将为受损水生

2、态系统的原位修复提供科学依据。FISH技术及其在微生物学中的应用李晓晶摘要：微生物对整个生态系统具有重要的影响，了解与检测微生物的种类具有十分重要的意义。但是传统的培养方法头不能满足科学研究的需要，荧光原位杂交技术(FISH)就是今年发展起来的一种快速准确检测微生物的方法。较全面地介绍了FISH技术的优点、微生物的分离与固定方法，以及原位杂交过程，同时对FISH技术在环境微生物学中的应用作了详细研究。关键词：荧光原位杂交检测环境微生物学种属特性功能特性污水处理、受损水生态系统的原位修复均与微生物有着密切的关系。因此，对于相关微生物的研究是这一领域的

3、重要研究内容之一。当前，在自然界的微生物群落中绝大部分种类尚不能进行培养(如海水中可培养的微生物只占到总数的0.001%〜0.1%；淡水水体或底泥中相对较多，但也只占到总数的0.25%⑴)o为了在尽量不破坏周围坏境的基础上研究这些尚无法培养的微生物，在过去的十多年里，微生物学家引入了分子生物学技术，如荧光原位杂交(FISH)、多聚酶链(PCR)、DNA测序、变性梯度凝胶电泳(DGGE)等叫这些技术在微生物生态学中的应用揭示了坏境中微生物群落结构与多样性的大量信息。然而，这些方法一般不能检测微生物在其生存的微生态坏中的功能特性。而在研究微生物时,不管

4、是研究微生物的富集培养与分离，还是研究微生物技术的应用都需要在了解微生物分类鉴定的同时，了解微生物的各种功能特性。有研究者己经开发了一些可以同时研究微生物分类鉴定与功能特性的方法，如FISH/CTC还原结合、MAR(微量自动照相术)与免疫荧光联用技术、FISH-微电极技术等，但这些技术在研究复杂坏境微生物群落中的个体微生物时存在很多局限［3切。上世纪末,研究者开发研究了一种新技术，即荧光原位杂交(FISH)与微量自动射线照相(MAR)集成技术(本文中FISH/MAR技术)，也有称其为MAR-FISH、STARFISH、Micro-FISH等〔网。应

5、用FISH/MAR能同时在原位水平从复杂微生物种群中获得待定微生物的种属与功能特性，从而更好地了解特定微生物在坏境中的作用，更清楚地解释自然或人工生态系统中微生物多样性与微生物群落结构多样性的原因及其与微坏境的相关关系。1FISH技术简介1.1原理FISH(fluorescenceinsituhybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是：如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核昔酸标记上报告分子如生

6、物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲与素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。1.2实验流程FISH样本的制备一探针的制备-＞探针标记一杂交-＞染色体显带一荧光显微镜检测一结果分析。1.3特点原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记与非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是FISH技术。FISH

7、技术作为非放射性检测体系，具有以下优点：1、荧光试剂与探针经济、安全；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在lkb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列：6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液屮显示间期染色体DNA的结构。缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。1.4应用该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染

8、色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。2FISH技术在环境微生物研究中的应用2.1工程系统中