《基因测序及分析》PPT课件

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1、基因测序及分析人类基因组线粒体基因组(16.6kb)核基因组(3200Mb)基因外序列基因和基因有关序列约10%约90%专一或中等重复序列Non-codingDNA假基因内含子基因片段<10%>90%专一的或低拷贝数序列中度至高度重复序列20~30%70~80%分散重复序列串联重复序列/成簇重复序列约60%约40%蛋白编码基因rRNA基因tRNA基因CodingDNA序列测定的技术杂交测序法质谱法单分子测序法原子探针显微镜测序法DNA芯片法经典方法:Sanger双脱氧链终止法(Sanger,1977)Maxam-GilbertDNA化学降解法(

2、Maxam&Gilbert,1977)新技术方法:与PCR反应类似。反应体系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和测序引物；反应过程：变性－复性－延伸－终止Sanger双脱氧终止法Dideoxynucleotides（双脱氧核苷酸）ddNTPs是反应终止剂可以当作正常碱基参与复制，一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs(一般1：3~4)。*少一个－OH脱氧核甘酸与双脱氧核甘酸结构比较Sanger第一步：加入复制终止剂荧光检测探头电泳，看谁跑得快ddNTPs参与下的DNA复制Sang

3、er法测序产物的平均链长取决于ddNTP：dNTP的比例，比例高时，得到较短的产物；“标记／终止法”测序产物的平均长度可通过标记反应中dNTP浓度(高浓度能得到长的产物)或终止反应的ddNTP:dNTP来调整。Sanger第二步：荧光检测GelElectrophoresisDNAFragmentSizeDeterminationDNA带负电DNA在电泳胶中的迁移率与其片段大小有关AnalyzedRawData除核苷酸序列文本文件外，全自动测序仪还提供曲线图。Tracediagramsareanalyzedbybasecallingprogram

4、sthatusedynamicprogrammingtomatchpredictedandoccurringpeakintensityandpeaklocation.Basecallingprogramspredictnucleotidelocationsinsequencingreadswheredataanomaliesoccur.Suchasmultiplepeaksatonenucleotidelocation,spreadoutpeaks,lowintensitypeaks.Maxam-Gilbert法一个末端标记的DNA片段在几组互

5、相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。因此生成一系列放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。碱基特异性化学切割反应：硫酸二甲酯（DMS）：使DNA分子中鸟嘌呤（G）上的N7原子甲基化。肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶环断裂；但高盐条件下，只C断裂，而不与T反应。哌啶：从修饰甲

6、基处断裂核苷酸链。在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落。T+C反应：肼（低盐）C反应：肼（高盐）测定DNA长度~250bp。化学裂解法测定DNA的核苷酸序列杂交法SBH（Sequencingbyhybridization）用特定长度的具有所有可能碱基序列的寡核苷酸探针与未知序列的DNA片段杂交。根据某些探针形成的完全双链，推知目的DNA的碱基序列。基因组测序在大规

7、模DNA测序中，目标DNA分子的长度可达上百万个bp。现在还不能直接测定整个分子的序列，然而，可以得到待测序列的一系列序列片段。序列片段是DNA双螺旋中的一条链的子序列（或子串）。这些序列片段覆盖待测序列，并且序列片段之间也存在着相互覆盖或者重叠。在一般情况下，对于一个特定的片段，我们不知道它是属于正向链还是属于反向链，也不知道该片段相对于起点的位置。另外，这样的序列片段中还可能隐含错误的信息。序列片段的长度范围300－1000bp，而目标序列的长度范围是3100万bp，总的片段数目可达上千个。DNA序列片段组装（sequenceassemb

8、ly)，又称序列拼接）的任务就是根据这些序列片段，重建目标DNA序列。如果能够得到DNA一条链的序列，那么根据互补原则，另一条链的序列也就得到了。DN