《固相析出分离法》PPT课件

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1、第五章固相析出分离法目的：浓缩；初步纯化；将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。固相析出法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。概述固相析出分离法：生化物质目的物经常作为溶质存在于溶液中，改变溶液条件，使它以固体形式从溶液中分离的操作技术。固相析出操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。固相析出法不仅用于实验室中，因其不需专门设备，且易于放大，也广泛用于生产的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。

2、优点：操作简单、经济、浓缩倍数高缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强盐析法有机溶剂沉淀法固相析出法等电点沉淀法结晶法其它多种沉淀法结晶法：析出物为晶体。沉淀法：析出物为无定形固体。固相析出法分类第一节盐析法第二节有机溶剂沉淀法第三节其它沉淀方法第四节结晶第一节盐析法一、基本原理二、影响因素三、盐析操作定义：盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。优点：简单、经济、较少变性缺点：分辨率不高；沉淀含大量盐析剂，要除盐；产生氨的恶臭7两种现象：盐溶：低盐情况，盐离子强度的增高，蛋白质溶解度增大

3、盐析：高盐，盐离子强度增加，蛋白质溶解度减小87/15/2021南京农业大学生命科学学院97/15/2021南京农业大学生命科学学院10一、基本原理11盐析作用（saltingout）原理破坏双电层：在高盐溶液中，带大量电荷的盐离子能中和蛋白质表面的电荷，使蛋白质分子之间电排斥作用相互减弱而能相互聚集起来。破坏水化层：中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀。logS=-KsS——蛋白质溶解度，g/L；—盐离子强度,Ci——i离子浓度，mol/L；Zi——i离子化合价；——常数,为纵坐标上的截距;Ks—

4、—盐析常数。13盐析和KS盐析右图示：盐离子浓度与蛋白质溶解度关系曲线，在盐析区，符合公式两种类型：（1）在一定的pH和温度下改变离子强度（盐浓度）进行盐析，称作Ks盐析法。由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。（2）在一定离子强度下仅改变pH和温度进行盐析，称作β盐析法。由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，后期分离（结晶）14二、影响盐析的因素1.无机盐的种类在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱阴离子盐析效果：柠檬酸＞PO43-＞SO

5、42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-阳离子盐析效果：NH4+＞K+＞Na+＞高价阳离子阴离子的影响大于阳离子盐析用盐的选择盐析作用要强盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐必须是惰性的来源丰富、经济盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂（1）价廉；（2）溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来；（3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，（4）不易引起蛋白质变性。缺点：（1）水解变酸；（2）高pH释氨，腐蚀；（3）残留产品有影响。不同种类蛋白质——所需的无机盐量不同先后加入不同量无机盐—分级沉淀蛋白质2.溶质（蛋白质等）种类：Ks、β不同蛋白

6、溶解度与离子强度的关系盐析分布曲线19蛋白质浓度不同：所需无机盐用量不同蛋白质浓度高：所需无机盐量少制成品：可适当高浓度，但浓度过高，易共沉淀重叠蛋白分级：适当稀释，共沉淀小，但回收率降低。3.溶质（蛋白质等）浓度：2~3%不同浓度碳氧肌红蛋白的盐析分布曲线无机或稀盐溶液：T↑蛋白质溶解度↑高盐溶液：T↑蛋白质溶解度↓蛋白质：室温盐析对温度敏感的酶，0⁰C~4⁰C4.温度：温度对溶解度的影响5.pH：Pl盐析注意高盐下pl的偏移：与负离子结合向低pH偏移，与正离子结合向高pH偏移利用蛋白质pl的不同：可分级沉淀蛋白质三、盐析操作1.盐析用盐的浓度表示硫酸铵的加入有以下几种方法：1）加入固

7、体盐法用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；2）加入饱和溶液法用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。3）透析平衡法先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，故