第2章_2.3 固相析出分离法

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1、Chapter2Chapter2Chapter2Chapter2生物活性物质粗分生物活性物质粗分生物活性物质粗分生物活性物质粗分的常用方法的常用方法的常用方法的常用方法2.32.32.32.3固相析出分离法固相析出分离法固相析出分离法固相析出分离法通过本章学习应掌握以下内容通过本章学习应掌握以下内容u何谓盐析？其原理是什么？u盐析操作时常用的盐是什么？u影响盐析的主要因素有哪些？u有机溶剂沉析法的原理是什么？u影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？u等电点沉析的工作原理是什么？u其它常用的沉析方法有哪些？何谓固相析出？何谓固相析

2、出？u改变溶液条件使其中的某种或某类溶质或杂质以固体的形式从溶液中分出的操作技术。–特点：操作简单、经济、浓缩倍数高–种类：盐析、有机溶剂沉析、等电点沉析等–缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强一般固相析出的操作过程一般固相析出的操作过程Step1Step1在经过滤或离心后的样品中加入沉淀剂；在经过滤或离心后的样品中加入沉淀剂；Step2Step2沉淀物的陈化，促进晶体生长；沉淀物的陈化，促进晶体生长；Step3Step3离心或过滤，收集沉淀物；离心或过滤，收集沉淀物；注：加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率

3、和沉淀物的形状都有很大影响2.3.12.3.1盐盐析析概念：在概念：在高浓度高浓度的的中性盐中性盐存在下，蛋白质（酶）存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在等生物大分子物质在水溶液水溶液中的中的溶解度降低溶解度降低，，产生产生沉淀沉淀的过程。的过程。u盐析是可逆的，而变性是不可逆的u早在1859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级中使用，得到了比较满意的结果。盐析录像蛋白质的溶解特性u蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。u蛋白质在自然环境中通

4、常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。u一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域蛋白质胶体溶液的稳定性防止蛋白质凝聚沉淀的屏障：⑴蛋白质周围的水化层（hydrationshell)可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。⑵蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层）因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度（ζ电位）降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀。盐析法机理1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集。–将盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，–使

5、蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，–蛋白质分子因热运动碰撞聚集。盐析法机理22）破坏水化膜，暴露出憎水区域）破坏水化膜，暴露出憎水区域u由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀u憎水区域越多，越易沉淀。盐析法机理3）中和电荷，减少静电斥力–中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，–导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。+++H+_++______+_+++_____+++++OH-+_+pHpI,带负电，有水膜，是稳定膜，是不稳定的有水膜，是稳定的亲水

6、胶体亲水胶体的亲水胶体中性盐中性盐中性盐破坏水膜破坏水膜破坏水膜+++中性盐_++_中性盐___+++中和电荷_中和电荷__+++2-_+NH4+__+++SO4___+或Na+蛋白质沉淀蛋白质的盐析机制示意图盐析过程盐析过程u当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：（1））“盐溶盐溶”现象(salt-in)—低盐浓度下，增加蛋白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大。（2））“盐析盐析”现象(salt-out)—高盐浓度下，中和电荷高盐浓度下，中和电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降。。盐析用盐的选择�盐析作用要强

7、盐析作用要强�盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐需有较大的溶解度�盐析用盐必须是惰性的盐析用盐必须是惰性的�来源丰富、经济盐析用盐的选择盐析用盐的选择u在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异u一般规律为：–半径小的高价离子的盐析作用较强，–半径大的低价离子作用较弱盐析用盐的选择盐析用盐的选择�阴离子盐析效果：柠檬酸＞PO43-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-�阳离子盐析效果：NH4+＞K+＞Na+＞高价阳离子�阴离子的影响大于阳离子碳血红蛋白在不同盐溶液中的盐溶和盐析盐析用盐的选择u盐

8、析中常用的盐：–硫酸铵、–硫酸钠、–磷酸钾、–磷酸钠–硫酸铵：是最常用的蛋白质盐析沉淀剂常用盐析剂在水中的溶解度（g/100ml水）温度（oC）中性盐020406080100(NH4)2SO470.675.481.088.095.3103Na2SO44.918.948.345.343.34