《受体细胞》PPT课件

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1、(1)受体细胞(2)重组DNA分子转入受体细胞(3)重组子的筛选目的基因导入受体细胞第1节受体细胞受体细胞(receptorcell)又称宿主细胞或寄主细胞(hostcell)实验技术:能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞实验目的:有应用价值和理论研究价值可作为受体细胞的原则:①便于重组DNA分子导入②便于重组DNA分子稳定存在于细胞中③便于重组子的筛选④遗传稳定性高，易于扩大培养与发酵⑤安全性高，无致病性⑥最好是内源蛋白水解酶缺失或含量低⑦密码子无明显偏爱性⑧具有较好的翻译后加工机制，便于真核基因的表达⑨理论与实践上具有较高的应用价值一.原核生物细胞作为受体细胞的优

2、点:(1)不具纤维素壁(2)无核膜(3)基因组简单，便于遗传分析(4)单细胞作为受体细胞的不足:(1)不具真核蛋白折叠系统(2)不具真核蛋白加工系统(3)蛋白酶降解异源蛋白目前作为受体菌的原核生物有:(1)大肠杆菌革兰氏阴性菌a.基因组、遗传背景了解最清楚b.易培养、繁殖迅速(2)枯草杆菌革兰氏阳性菌a.具胞外酶分泌-调节基因，能将表达产物分泌到培养基；b.无内毒素；c.易于保存与培养。(3)蓝细菌a.光能自养型，易于培养；b.与植物密码子和启动子的通用性，易于表达植物基因二.真菌细胞低等真核生物，具有真核生物基因结构、表达调控体系，具有真核的蛋白折叠、加工与分泌系统

3、酵母菌a.结构最简单的真核生物，遗传背景较为清楚b.蛋白翻译后修饰加工系统c.不含毒素d.易培养e.可分泌三.植物细胞具有纤维素参与组成的坚硬细胞壁原生质体转化(纤维素酶处理)基因枪或农杆菌直接转化植物细胞的突出优点:细胞具有全能性四.动物细胞多采用生殖细胞、受精细胞或胚细胞，近年用体细胞培养常用的动物细胞受体:小鼠L细胞、Hela细胞、猴肾细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等动物细胞的优点：可识别并除去内含子，加工成成熟mRNAb.翻译后加工，产物具有较好的免疫原性c.易感染，遗传稳定d.可分泌表达产物缺点：组织培养技术要求较高，周期长，难度大第2节重组DNA分子转入

4、受体细胞转化(transformation)重组DNA分子进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持并表达的过程一.重组DNA分子转入大肠杆菌细菌转化的本质(革兰氏阳性菌天然转化局部原生质体化假说):a.细菌感受态形成b.转化因子的吸收c.整合复合前体形成d.单链DNA转化因子的整合e.转化子的形成供体菌受体菌感受态单链整合、重组转化子非转化子对于来自于人工重组DNA,而非供体菌的游离DNA，革兰氏阴性菌大肠杆菌中，采用人工方法制备感受态1.Ca2+诱导大肠杆菌转化法①制备感受态细胞1970年，Mandel和Higa用Ca2+Cl2处理大肠杆菌，促进了大肠杆菌对λ噬菌体DN

5、A的吸收1972年，Cohen实现了质粒DNA对大肠杆菌的转化a.培养生命旺盛的菌体(对数生长期)A600约等于0.4b.沉淀细菌5000g离心5minc.化合物处理(CaCl2处理)冰浴菌液(4°C)加入等体积CaCl2溶液,15min冰浴菌液(4°C)4000g离心5min，弃去上清液冰浴菌液(4°C)中加入等体积CaCl2溶液,放置15min沉淀用1/15原体积CaCl2溶液重悬4°C下保存，备用(2天内)②DNA分子转化感受态细胞感受态细胞加入DNA分子42°C水浴上放置45秒(热激)会有DNA分子进入大肠杆菌细胞里CaCl2引起大肠杆菌细胞处于感受态可能的原

6、因:①Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使内外膜间核酸酶解离，诱导形成感受态②Ca2+能与DNA分子结合，使DNA与Ca2+复合物接近细胞膜，当42°C热激处理时，膜出现间隙，DNA分子进入Flash2Flash12.电穿孔转化法1988年，Dower等人转化大肠杆菌基本原理:高压电脉冲导至电穿孔(electroporation)制备感受态方法:冰浴重悬3.三亲本杂交转化大肠杆菌法三亲杂交(tri-parentalmating)结合转移法基于非结合型质粒的迁移作用建立的方法适于难以采用Ca2+诱导法和电穿孔法的受体菌三亲杂交过程结合型的辅助质粒含重组DNA质粒的供体

7、细胞受体细胞迁移作用4.转化效率计算及影响因素转化效率两种表示方式:①转化率=转化子/DNA分子个数或转化率=转化子/DNA质量②转化率=转化子/受体菌总数转化效率的影响因素①质粒大小、结构(超螺旋与否)、与宿主亲和性、质粒浓度(与转化效率正比例关系)②不同受体细胞具不同转化效率③转化方法不同具不同转化效率电穿孔法〉Ca2+诱导法〉三亲杂交法二.重组λ噬菌体DNA分子转导大肠杆菌转染(transfection)与质粒DNA转化方式相似，重组λ噬菌体DNA分子直接导入到受体细胞重组型转化率103-104pfu(plaueforminguint)转导(t