《凝胶电泳技术》PPT课件

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1、凝胶电泳技术电泳（electroghoresis）：带电物质在电场中向相反电极移动的现象。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯

2、酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。电泳的基本原理：在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。F＝QE质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：F′＝6πrην式中r为质点半径，η为介质粘度，ν为质点移动速度，当质点在电场中作稳定运动时：F＝F′即QE＝6πrην球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成正比，与其半径及介质粘度成反比。除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。电泳迁移率（m）是指在单位电场强度（1V/cm）时带电分子的迁移速度迁移率与带电分子

3、所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。为了获得好的电泳结果，应尽量减少电荷效应，增加分子筛效应。常用的凝胶电泳有两类：琼脂糖凝胶电泳：分辨率稍低，适于较大分子。聚丙烯酰胺凝胶电泳：分辨率高，适于较小分子。一、影响凝胶电泳迁移率的因素（一）样品的物理性质1、分子大小线状双链DNA分子长度（碱基对数目bp）的对数（log10）与迁移距离成反比，以此来测定DNA片段（线性双链）的分子量准

4、确且方便。EB嵌合使迁移率下降15%。当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。2、分子的空间构型：即使分子量相同，构型不同，其迁移率也不同。DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：共价闭合环状DNA（covalentlyclosecircularDNA，cccDNA，超螺旋构型）＞lDNA（linearform，线型，质粒的两条链均断裂；线性分子）＞ocDNA（开环DNA，opencircularDNA，ocDNA，它的双链中的

5、一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口）。但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。3、带电量：核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。4、碱基组成：对迁移率影响不明显，单链DNA形成发头结构，影响迁移率，单链（1kb）小于双链DNA（1kb）(二)支持物介质（种类和浓度）核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和

6、聚丙烯酰胺凝胶两种介质，琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同，适于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）在N,N,N′-四甲基乙四胺（TEMED）和过硫酸铵（AP）的催化下聚合形成长链，并通过交联剂N,N′-亚甲双丙烯酰胺（Bis）交叉连接而成，其网孔的大小由Acr与Bis的相对比例决定。凝胶浓度浓度越小，孔径越大，浓度越大，孔径越小。不同浓度琼脂糖凝胶的有效分离范围浓度%（W/V）线状DNA分子的有效分离范围（kb）0.35－600.61－200.70.8－100.90.5－71.20.4－61.51.2－32

7、.00.1－2DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围聚丙烯酰胺浓度有效分离范围（bp）二甲苯青FF溴酚蓝3.51000－20004601005.080－500260658.060－4001604512.040－200702015.025－150601520.06－1004512（三）电场强度电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势梯度。1-5V/cm（低压），低压时，线性DNA迁移率与电压成正比，而对于大片段电泳，甚至用0.5-1.0V/cm电泳过夜。电场强度愈大，带点颗粒