琼脂糖凝胶电泳技术

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1、琼脂糖凝胶电泳技术［目的要求］通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术［实验原理］琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的;臭化乙锭(ethidumbromid

2、efEB),在紫外光下可以检出10ng的DNA条带,在电场中，pH&O条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。琼脂糖凝胶有如下特点：(l)DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。(2)琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。(3)电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度

3、增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cmo(2)电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显,不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4°C与30°C之间不发生明显改变,但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4°C条件下电泳。(3)嵌入染料荧光染料溟化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。(

4、4)离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸憎水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中(如误加10x电泳缓冲液)，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。对于天然的双链，常用的几种电泳缓冲液有TAE、TBE等，一般配制成浓缩母液，室温保存，用时稀释。［实验仪器与设备］1•恒温培养箱2.琼脂糖凝胶电泳系统3.高压灭菌锅4.紫外线透射仪［实验材料］1•三轻甲基氨基甲烷(Tris)2硼酸3.乙二胺四乙酸(EDTA)4.；臭酚蓝5•蔗

5、糖6.琼脂糖9.DNA样品［实验步骤］1•缓冲液的配制①5xTBE(5倍体积的TBE贮存液)配1000ml5xTBE:Tris54g硼酸27.5g0.5mol/lEDTA20mlPh8.0②凝胶加样缓冲液(6x)溟酚蓝0.25%蔗糖40%③;臭化乙锭溶液(EB)0.5gg/ml2•制备琼脂糖凝胶按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表:琼脂糖凝胶浓度线性DNA的有效分离范围0.3%0.6%0.7%0.9%1.2%1.5%2.0%3•胶板的制备5-60kb1-20kb0.8-1

6、0kb0.5-7kb0.4-6kb0.2-4kb0.1-3kb(1)用高压灭菌指示纸带将洗静、干燥的玻璃板的边缘(或电泳装置所皿备的塑料盘的开口)封住，形成一个胶膜(将胶膜放在工作台的水平位置上，用水平仪校正)。(2)配制足够用于灌满电泳槽和制备凝胶所需的电泳缓冲液(lxTBE)o准确称量的琼脂糖粉。缓冲液不宜超过锥瓶或玻璃瓶的50%容量。在电泳槽和凝胶中务必使用同一批次的电泳缓冲液，离子强度或pH值的微小差异会在凝胶中形成前沿，从而大大影响DNA片段的迁移率。(3)在锥瓶的瓶颈上松松地包上一层厚

7、纸。如用玻璃瓶，瓶盖须拧松。在沸水浴或微波炉中将悬浮加热至琼脂糖溶解。注意：琼脂糖溶液若在微波炉里加热过长时间，溶液将过热并暴沸。应核对溶液的体积在煮沸过程中是否由于蒸发而减少,必要时用缓冲液补充。(4)使溶液冷却至60°Co加入漠化乙锭(用水配制成10mg/ml的贮存液)到终浓度为0.5ug/ml,充分混匀。(5)用移液器吸取少量琼脂糖溶液封固胶模边缘，凝固后，在距离底板0.5-10mm的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。如果梳子距玻璃板太近，则拔出梳子时孔底将有破裂的危险，

8、破裂后会使样品从玻璃板之间渗透。(6)将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶模中。凝胶的厚度在3-5mm之间。检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。(7)在凝胶完全凝固后(于室温放置30-45分钟)，小心移去梳子和高压灭菌纸带,将凝胶放入电泳槽中。低熔点琼脂糖凝胶及浓度低于0.5%的琼脂糖凝胶应冷却至4°C，并在冷库中电泳。(1)加入恰好没过胶面约1mm深的足量电泳缓冲液。4.加样DNA样品与所需加样缓冲液混合后，用微量移液器,慢慢将混合物加至样品槽中。此时凝胶已浸没在缓冲液中。一个加样孔的最