CD146分子促进乳腺癌侵袭转移的机制研究

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1、密级：博士学位论文CD146分子促进乳腺癌侵袭转移的机制研究作者姓名：曾启群指导教师:阎锡蕴研究员中国科学院生物物理研究所学位类别:博士学科专业:细胞生物学培养单位:中国科学院生物物理研究所2012年5月TheeffectsandmolecularmechanismsofCD146inbreastcancerinvasionandmetastasisByQiqunZengADissertationSubmittedtoGraduateUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfu

2、lfillmentoftherequirementForthedegreeofDoctorofCellBiologyInstituteofBiophysics,ChineseAcademyofSciencesMay,2012摘要摘要侵袭转移是恶性肿瘤最致命的特征，该过程受到肿瘤细胞本身、肿瘤微环境以及肿瘤细胞与远端脏器相互作用等一系列因素的复杂调控，并导致大于90％肿瘤相关性死亡。我们实验室及其他实验室的研究均表明细胞黏附分子CD146分子与恶性肿瘤相关，可能参与肿瘤侵袭转移的过程。然而，CD146分子在肿瘤转移侵袭过程究竟发

3、挥什么作用，其中涉及的机制及相关信号通路又是什么，都不是很清楚。在此项研究中，我们选用乳腺癌为研究模型来探索CD146分子在肿瘤侵袭转移中的功能及其中涉及的机制。我们发现在上皮性质乳腺癌细胞中过表达CD146分子导致了上皮-间质转化（Epithelial-MesenchymalTransition,EMT），细胞形态由紧密连接的铺路石状变为长梭形，上皮细胞标记分子E-cadherin及Cytokeratin表达下调，而间质细胞标记Vimentin及Fibronectin重新表达，细胞也因此获得极强的迁移及侵袭能力，以及某些类似

4、于乳腺癌干细胞的特征。同时，在间质性质乳腺癌细胞中下调CD146表达将抑制乳腺癌细胞的间质特征及恶性转移行为。我们进一步探索了CD146诱导EMT发生的分子机制，发现CD146的过表达激活了小G蛋白RhoA，进而上调EMT重要转录因子Slug的表达；Slug在转录水平抑制EMT关键分子E-cadherin的表达，从而起始整个EMT过程。更重要的是，原位移植乳腺癌小鼠模型表明CD146诱导乳腺癌细胞发生EMT在体内水平促进肿瘤形成，降低肿瘤分化程度，并促进肿瘤发生原位侵袭及远端转移。同时，我们对505例乳腺癌组织进行免疫组化分析

5、发现，CD146的表达与肿瘤分级高、细胞增殖标记分子Ki-67的表达以及患者预后差相关。更有意思的是，CD146分子在恶性程度及致死率最高并具有EMT特征的三阴性乳腺癌中高表达（68.9％），并与E-cadherin的表达呈负相关，为我们之前的细胞实验及动物实验提供临床依据。总而言之，我们的研究表明CD146分子通过诱导乳腺癌细胞发生EMT的机制来促进乳腺癌的侵袭转移，因此，CD146可以作为治疗乳腺癌的一个新靶标，尤其是针对三阴性乳腺癌。我们的后续工作中发现，CD146过表达后完全间质转化的乳腺癌细胞在Matrigel胶上能

6、自发形成血管样结构，或者与人脐静脉内皮细胞HUVEC共同形1CD146分子促进乳腺癌侵袭转移的机制研究成血管样结构，而靶向CD146的siRNAs则可以抑制这些功能，暗示着CD146分子诱导EMT发生可能进一步参与了肿瘤血管拟态或马赛克血管形成。也就是说，CD146分子可能促进乳腺癌细胞发生上皮-间质-内皮转变（Epithelial-Mesenchymal-EndothelialTransition，EMET）。同时，为了进一步探索CD146诱导EMT发生下游复杂的信号调控网络，我们结合了SILAC标记及Affymetrix基

7、因芯片的方法，试图从蛋白水平及mRNA水平揭示在乳腺癌细胞中由CD146表达引起的信号通路及调控网络的变化，希望借此来发现CD146分子的新功能及新机制。本论文的第二部分工作为利用Cre-LoxP系统构建内皮特异性CD146基因敲除小鼠，在体内水平探索CD146分子在血管生成中的功能。我们在小鼠CD146基因启动子区及第一个外显子区两端的内含子区插入两个LoxP位点，获得CD146条件性基因敲除小鼠(CD146floxed/floxed)，再将该小鼠与内皮细胞特异性表达Cre酶的小鼠（Tie2Cre/+）进行杂交，最终获得内皮

8、特异性CD146基因敲除小鼠(CD146EC-KO)。该小鼠不会胚胎致死，且可正常繁育后代，成体中视网膜血管形态及密度均未见异常。为了进一步探索CD146分子在病理血管生成中的作用，小鼠黑色素瘤细胞B16F10及纤维肉瘤细胞MCA-205被皮下注射到CD146EC-KO小鼠及