分子生态学实验步骤及原理总结

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1、（一）基因组DNA提取上海博彩生物科技有限公司：3SDNAIsolationKitforEnvironmentalSamplesV2.23S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒V2.2DNA抽提方法使用仪器：灭菌锅，无菌操作台，移液枪，漩涡振荡器，台式离心机，水浴锅，分光光度计或者琼脂糖电泳槽灭菌物品：枪头，1.5ml，2ml离心管一、污泥样品前处理样品在处理前首先要混匀，使其中的悬浮物质分布均匀。取约l0mL污水样品，加入灭菌离心管，400Orpm、离心20min，收集沉淀，加约4倍体积的TENPbuff

2、er(50mMTirs，20mMEDTA，100mMNaCl，0.01g/mLPVP，pHl0)，加玻璃珠(d:lmm)充分匀化(解絮凝)。4000rpm，离心20min，弃上清(重复两次，直至上清液较澄清)。加约4倍体积的PBSbuffer(8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4溶于lL水、pH7.4)，旋涡混匀，4000rpm，离心20min，收集沉淀(重复两次)二、基因组DNA提取1.样品准备：100mg样品用200ulSolutionSUS将样品浸泡、悬浮

3、，使样品软化分散开。2.加入400ulSolutionLYS，300mg石英砂，盖上离心管盖，在漩涡振荡器上高速剧烈振荡，10-30min或更长时间。3.用台式离心机，12000rpm，室温离心5min。4.将上清液完全转移到无菌1.5ml离心管中，加入120ulSolutionBID，盖上离心管盖，上下颠倒混匀。将溶液用1mlTIP全部转移到3S柱内，柱子放入2ml离心管中，不盖离心管盖，室温放置2min以上。5.盖上离心管盖，12000rpm，室温离心1min。6.取下3S柱，弃去离心管中的废液。将

4、柱子放回同一根离心管中，加入600ulWashSolution，10000rpm，室温离心1min。7.重复6一次。8.取下3S柱，弃去离心管中的全部废液。将柱子放回同一根离心管中，10000rpm，室温离心2min，以除去残留的WashSolution。9.洗脱：在柱子中央加入100ulTE，将柱子放入新的干净1.5ml离心管中，室温放置2min。12000rpm，室温离心1min。收集管中的液体即为基因组DNA。根据用途，样品可以4℃或-20℃保存。为提高洗脱效率，可以将TE预热到37-55℃。如果

5、样品中基因组DNA含量很低，用30ulTE洗脱可以提高洗脱液的样品浓度，但产率有所下降。重复该洗脱步骤一次，可以提高产率20%左右。三、提取DNA的质量检测(1)DNA纯度和浓度检测用紫外分光光度计测定DNA样品在波长230，260，280nm处的吸光光度值。DNA纯度的定性检测:通过A260/A280及A260/A230的比值可以检测所提DNA是否纯。通常纯DNA样品A26O/A280≈1.8，A260/A230>2。若A260/A280>l.9，可能有RNA污染；若A260/A280

6、蛋白质污染；若A260/A230≤2，可能存在酚类等小分子杂质。DNA浓度的计算：浓度(µg/mL)=A260*50*稀释倍数；注：1OD值相当于50µg/mL双螺旋DNA。(2)DNA琼脂糖凝胶电泳检测将所得DNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳，电压100V，电泳lh，EB染色后，用紫外凝胶成像系统拍照。（二）PCR扩增一、PCR扩增引物采用两组对大多数细菌和古细菌的16SrRNA基因V3区具有特异性的引物对：组合(F34，GC和RS:8)。引物组合的正向引物5’端中有一个富含GC的40bp的GC发卡结构

7、。它们各自序列分别为:F341:(5’一eCTACGooAooeAGeAo一3’)，Rsls:(5’一ATTACCGCGGCTGCTGG一3，)，GC发卡结构(5’一CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG一3’)。引物组合扩增产物片段长度约为220bp。二、PCR扩增反应体系PCR扩增反应体系，与表3一3相同。加样后立即进行PCR扩增。三、PCR扩增程序PCR扩增程序，与表3一4相同。四、PCR产物电泳检测取5闪PCR产物进行电泳，胶浓度为2.0%，在电压100

8、v条件下电泳lh后检测，经EB染色后用凝胶成像系统观察，保存凝胶图谱。电泳所用Marker为天根生化科技(北京)有限公司生产的nNAM叭e:nLZo00。（三）变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析预电泳的作用1.使体系达到反应的条件2.清除过多的变性剂和APS等，保持胶的稳定状态。聚丙烯酰胺凝胶电泳　　聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析。其装载的样品量大，回收DNA纯度高。长度仅相差0.2%(即