产糖化酶菌株的诱变

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1、产糖化酶菌株的诱变一、实验目的 1）学习了解工业微生物育种的基本原理。2）学习利用物理因素（紫外光）诱变育种的方法。 3）对有一定能力产糖化酶的菌种进行紫外线诱变，并获得产酶能力更强的突变菌株。 二、实验原理 利用物理或化学因素处理微生物细胞群体，促使其中少数细胞的遗传物质的分子结构发生改变，从而引起菌体发生遗传性的变异，再用合理的筛选方法从群体中筛选出少数具有优良性状的菌株，这种育种方法称为诱变育种。诱变育种是提高菌种产量，获得新型变异菌株的主要手段。 紫外线（UV）是一种最常用有效的物理诱变因素。其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变（链或氢键的断裂，胞嘧啶的

2、水合作用、胸腺嘧啶二聚体的形成）而造成的。紫外线诱变一般采用15W或30W紫外线杀菌灯，照射距离为20cm～30cm，照射时间为1～3min，死亡率控制在50%～80%为宜，被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞菌悬液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯菌的出现。 三、实验材料 1、微生物菌种 产糖化酶的霉菌 2、培养基与试剂 1）增值培养基：硝酸钠：2g磷酸氢二钾：1g硫酸镁:0.5g氯化钾0.5g硫酸亚铁0.01g蔗糖:30g琼脂:15g筛选培养基：可溶性淀粉1.3%,(NH4)2SO40.3%,KH2PO40.1%,MgSO4·7H2O0.05%,FeSO

3、·7HO0.001%、琼脂粉1.8%加热溶解，分装后121℃灭菌20min、自然pH。 诱导产生孢子：在37℃和5℃的条件下交替进行培养。3、玻璃器皿：培养皿30套、150mL三角瓶、试管数支、量筒、接种环等 4、仪器：恒温摇床培养箱、紫外灯（30W）、电子天平、超净工作台、冷藏箱、高压蒸汽灭菌锅。 四、实验方法和步骤 （一）培养基的制备增值培养基：硝酸钠：2g磷酸氢二钾：1g硫酸镁:0.5g氯化钾0.5g硫酸亚铁0.01g蔗糖:30g琼脂:15g筛选培养基：可溶性淀粉1.3%,(NH4)2SO40.3%,KH2PO40.1%,MgSO4·7H2O0.05%,FeSO

4、·7HO0.001%、琼脂粉1.8%加热溶解，分装后121℃灭菌20min、自然pH。 （二）灭菌与平板斜面制备 将装有培养基的三角瓶塞上棉花，并用报纸包好，拴上绳子。再用报纸包30套培养皿、30根竹签、试管等实验器皿。将上述材料放置于高压灭菌锅内进行灭菌，注意试管要直立放置。严格遵守高压灭菌锅的使用方法。（三）活化菌种并促其产孢 将培养箱中培养的平板，接种环（针）、活化培养皿、酒精灯放在超净工作台。用接种环（针）挑取保存的菌种在平板上迅速划动，注意勿划破培养基，写好标签。做好后将活化平板倒置放在恒温培养箱中培养24～48h。待菌株长出后，改变其培养环境，如将培养基放

5、于冰箱一会再放回培养箱中，待其产孢后用加有少量吐温80的缓冲液或生理盐水洗平板内霉菌的孢子，制成孢子悬液,在磁力搅拌器下搅拌14分钟。则得到10-1的孢子悬液，再用移液枪汲取1ml10-1浓度的孢子液于9ml无菌水中，摇匀，即为10-2浓度样品，同法依次稀释到10-3，塞上塞子，写好编号、时间和样品名称。（四）、镜检 取孢子悬液于载玻片上制成水侵片，在显微镜下观察是否为单孢子悬液，若发现孢子液不是单个的孢子，则可以在孢子液中加入适量的几丁质酶或蜗牛酶。 （五）、计数 （1）镜检计数板的计数室 在加样前，先对计数板的计数室进行镜检，若有污物则需清洗。 1、用95％酒精轻

6、轻冲洗计数板的计数室。 2、用蒸馏水清洗计数板，然后用吸水纸吸干其上的水分，最后用擦镜纸擦干净。 （2）加样品 1、将洁净的盖片置于血球计数板的两条嵴上。 2、用无菌滴管吸取少许摇匀的孢子液由盖玻片边缘滴一小滴，注意不宜加过多孢子液，加样前要摇匀菌液，加孢子液时不得使计数室内有气泡，两个平台上都滴加孢子液。 3、让孢子液沿细缝靠毛细渗透作用自行渗入计数室，并充满计数室平台。 计数 加样后静置约5min后，将血球计数板置于显微镜镜台上，先用低倍镜找到计数室所在的位置，再转换成高倍镜进行计数。 （3）、计算方法 1、不同规格的计数板的计数方法有所差异。1625规格的计数板

7、，需要按对角线方位计算左上、左下、右上和右下4个中格（共100小格）的菌液；2516规格的计数板，除统计上述4个中格外，还须统计中央一中格共5个中格（共80小格）的菌数。 2、计数时当遇到位于中格线上的菌体时，一般只计数此中格上方及右方线上的菌体（或只计数此中格下方及左方线上的菌体）。 3、若在计数前或计数时发现菌悬液太浓，需重新稀释后再计数。 4、每一样品重复计数3～5次，取平均值。注意每次数值不应相差过大，否则重新操作。 （4）清洗血球计数板 使用完毕将血球计数板用流水清洗干净，切勿用硬物洗刷。洗完后自行晾干或用吹风机吹干，并镜检观察计数室内是否