Odyssey红外激光成像系统-蛋白研究的多功能平台

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1、Odyssey红外激光成像系统—蛋白研究的多功能平台WesternBlot常见检测方法化学显色法:灵敏度低，无法定量。放射自显影法：对身体有害，操作复杂。化学发光法:无法精确定量，操作复杂。抗原一抗结合红外荧光标记的二抗Infrareddye(IRD800,Alexa680)ODYSSEY成像原理INFRAREDLASERDIODEINFRAREDAPDDETECTOR准确定量Widelineardynamicrange操作简便,直接检测Nofilm,darkroom,ormessysubstrates灵敏度高Equaltoorbetterthan

2、chemiluminescence多色检测NormalizationincreasesquantificationaccuracyOdyssey系统的特点红外荧光－准确定量TIMETIMECHEMILUMINESCENCE动态信号－信号随时间变化信号不与目标蛋白浓度成比例关系ODYSSEY静态信号－信号不随时间变化信号和目标蛋白浓度成比例关系Highconcentration/signalMediumconcentration/signalLowconcentration/signalSaturationBackground0,00,0INTENS

3、ITY红外荧光定量Western－DEMO实验步骤Odyssey:膜+一抗孵育+荧光标记抗体孵育+Odyssey扫描成像ECL:膜+一抗孵育+酶联二抗孵育+底物显色+UVP扫描成像实验目的检测培养细胞转染外源基因的表达状况红外荧光定量Western－DEMOMarkerS1S2S3S4MarkerS1S2S3S4Odyssey结果ECL结果信号强度5120104信号强度302623019（Odyssey软件分析结果）结论Odyssey和ECL的相对灵敏度相差不大Odyssey红外激光成像系统具有更好的线性关系和更精确的定量结果Odyssey扫描图能

4、同时看到Marker和目标蛋白，ECL看不到Marker10:4:2:1稀释红外荧光优点－直接检测，操作简便膜上抗原一抗结合红外标记的二抗Odyssey直接扫描Infrareddye(IRD800,Alexa680)不需要底物不需要底片/暗室信号持久OdysseyVSECL流程ECLOdyssey1跑胶跑胶2转膜转膜3封闭封闭4结合一抗、洗涤结合一抗、洗涤5结合酶标记二抗、洗涤结合红外染料标记二抗、洗涤，成像6发光试剂盒7暗房曝光成像红外荧光优点－低背景NIRDyesBiomoleculesPorphyrinsVisibleFluorophores

5、PAHs1000nm800600400200Allothersequencers400-650nmLI-COR700-800nm硝酸纤维,聚偏氟乙稀（PVDF）,生物分子和尼龙等物质在可见荧光范围内有很高的自身荧光。红外荧光vs可见荧光膜背景信号红外——背景低、SN更高红外荧光VS化学发光定量线性范围Odyssey成像呈现一个很好的线性（定量准确）ECLODYSSEY红外荧光VS化学发光线性宽的成像效果Odyssey曝光３０秒曝光１分钟曝光５分钟曝光１０分钟Odyssey—双色同时检测800nm700nmOverlay两套独立激发检测系统700通道

6、：680nm激发720nm检测800通道：780nm激发820nm检测应用一：双色－定量western检测TargetproteinAnti-rabbit800channelNormalizertargetAnti-mouse700channel*Two-colordetectionrequiresprimaryantibodiesfromdifferenthosts应用二：双色－ERK的磷酸化Anti-ERKAnti-phosphoERKResultsOverlaidNon-StimulatedEGF-StimulatedNon-Stimulat

7、edEGF-StimulatedNon-StimulatedEGF-Stimulated700nmchannel800nmchannel700and800nm观察EGF刺激后A431细胞中ERK1andERK2(p44/42MAPkinases)的磷酸化情况,一抗分别是兔抗ERK抗体和小鼠抗磷酸化ERK抗体,二抗用抗兔的IRDye800标记的抗体(green),和抗鼠的Alexa680标记的抗体(red)ERK:胞外信号调节激酶EGF:表皮生长因子EMSA的简介EMSA(ElectrophoreticMobilityShiftAssay)凝胶迁移实

8、验是研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术。该技术是基于DNA/蛋白质或RNA/蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶