h第四章蛋白质工程概述

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1、第四章基因诱变与蛋白质工程概述自我介绍曲萌北华大学分子生物学教研室（419）医学博士在读电话：6605155邮箱：dzhqmdzh@yahoo.com.cn基因组学——蛋白质组学基因工程——蛋白质工程问题：1.基因组与蛋白质组有什么联系？2.蛋白质工程与基因工程的区别？DNAmRNA复制转录蛋白质表达胞浆核遗传信息流程图基因组与蛋白质组有什么联系？遗传信息从DNA到mRNA，然后合成各种结构蛋白质和功能蛋白质，构成有机体，完成生命的功能。基因是遗传信息的源头，而蛋白质是基因功能的体现者和执行者。HGP完成了基因序列的确定，但它不能提

2、供认识各种生命活动的直接分子基础，所以必须研究生命活动的执行者——蛋白质。蛋白质组学的研究宗旨就是解决这个问题。蛋白质组的研究是对基因组研究的重要补充，也是后基因组时代研究基因功能的最重要途径。蛋白质组学研究的特点研究对象的整体性研究目标的动态性体现生命的复杂性研究对象的整体性当前蛋白质组学的主要任务是：传统上，我们只是对某一发育阶段或特定位置上的单个基因进行研究，缺乏对蛋白质全面、整体的认识，而蛋白质组学是把基因组所表达的全部蛋白质作为研究对象，在建立和发展蛋白质组研究技术方法的同时，进行蛋白质组分析。分析工作主要有两个方面：一方

3、面—建立正常生理条件下机体、组织、细胞的全部蛋白质的图谱和数据库，获得蛋白质组群的整体信息，为进一步的分析工作提供基础；另一方面—比较分析非生理条件下蛋白质组所发生的变化。研究目标的动态性组成有机体的所有不同细胞都共享一个基因组，即一个有机体只有一个确定的基因组。但基因组内各个基因的表达条件、程度都要随时间、地点、环境的不同而不同。所以，蛋白质组是一个动态的概念。体现生命的复杂性HGP表明：30亿对碱基，仅编码2.6-3.9万个不同的基因。人类的复杂性体现在表达产物的复杂性，即蛋白质的复杂性。证明★一个基因并不只存在一个相应的蛋白质

4、，可能有几个或几十个。★基因也不能直接决定一个功能蛋白。★很多疾病并不完全是因为基因改变所造成，基因的表达方式错综复杂。★同一个基因在不同的条件下，可能会起到完全不同的作用。★基因不能完全决定蛋白质后期加工、修饰及转运定位的全过程。基因工程的基本步骤目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达玫瑰的栽培历史可以追溯到5000年前，但通过色素呈现出蓝色的玫瑰却从来没有过。从蓝色三叶草中提取制造蓝色色素的基因，然后注入到玫瑰中，并成功地让翠雀花素单独显色。畜產系鄭登貴教授抗虫基因转殖烟

5、草荧光基因转殖鱼抗老化转殖兰花基因转殖羊目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线目的基因的分离与合成需要克隆的DNA片段：化学合成法cDNA文库基因组DNA文库聚合酶链式反应分:一、质粒载体(plasmid)质粒Plasmid：独立于细菌染色体外能自主复制的小型双链环状DNA分子。噬菌体(phage)λ噬菌体载体粘粒单链丝状噬菌体真核细胞的克隆载体SV40(猴肾病毒)载体穿梭载体反转录病毒载体人工染色体酵母人工染色体（yeastartificialchromosome,YAC）细菌人工染色体（BAC）噬菌体人P1衍生的人工染色

6、体（PAC）哺乳动物人工染色体（MAC）限制性内切酶酶切酶切切:目的基因基因载体重组体(复制子)基因重组接:连接方法1.粘性末端的连接(cohesiveendligation)2.同聚体加尾部连接(homoploymerictailsligation)3.人工接头法(artificiallinkerligation)转化：1)CaCl2处理后的转化2）电击法转染：1)CaCl2处理后的转染2）电击法3)其他方法：（1）聚乙二醇介导的转染法（2）磷酸钙-DNA共沉淀法（3）二乙胺乙基-葡聚糖介导的转染（4）原生质体融合（5）脂质体法（

7、6）细胞核的显微注射法转:一、根据载体的性状变化进行筛选1.抗药性标志筛选2.抗药性标志插入失活3.根据外源DNA片段性状筛选4.β-半乳糖苷酶系统二、根据重组DNA的结构特征进行筛选1.重组DNA的快速裂解与鉴定2.限制性内切酶图谱分析法3.核酸分子杂交方法进行鉴定4.PCR扩增方法进行鉴定筛:一、原核表达体系二、真核表达体系1.酵母表达体系2.昆虫表达体系3.哺乳类动物细胞表:概论1.蛋白质工程:崛起的缘由、概念2.常用技术：定点诱变（概念、意义）3.蛋白质改造范围4.改造类型基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，这些天

8、然蛋白质是生物在长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。蛋白质工程崛起的缘由由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键