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《大米蛋白的酶水解机制研究-酶水解过程中蛋白质的组分变化》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、2007年7月中国粮油学报Vo.l22,No.4第22卷第4期JournaloftheChineseCerealsandOilsAssociationJu.l2007大米蛋白的酶水解机制研究)))Ⅱ酶水解过程中蛋白质的组分变化12113王章存刘卫东申瑞玲郑坚强姚惠源1(郑州轻工业学院食品与生物工程学院,郑州450002)2(郑州牧业工程高等专科学校,郑州450008)3(江南大学食品学院,无锡214036)摘要凝胶色谱和高效液相色谱分析表明,大米蛋白在碱性蛋白酶Alcalase水解过程中,其可溶性蛋白组分的相对分子质量(Mr.)分布范围相对稳定,但Mr.1350u以
2、下小分子组分的相对含量不断增加;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析显示,随着酶水解反应的进行,Mr.为57、39、26、22ku的亚基逐渐消失,而29ku和13ku两个亚基的含量相应增加,且这两个亚基表现出可抵抗酶水解的特性。氨基酸分析表明,酶解后残余物蛋白中胱氨酸、蛋氨酸等含硫氨基酸的含量显著高于可溶性蛋白中的含量。圆二色光谱(CD)分析显示,酶水解前后大米蛋白的二级结构发生显著变化,在残余物蛋白质组分中自由回转的比例高达71.3%,A-螺旋结构完全消失。关键词大米蛋白酶水解机制亚基圆二色光谱大米蛋白是公认的优质植物蛋白。目前主要从1试验材
3、料和方法淀粉糖、有机酸等工业副产品中提取。因大米中主1.1实验材料和试剂要是不溶于水的谷蛋白且受到了高温作用,大米蛋大米分离蛋白(蛋白含量为85.2%,喷雾干燥),白的溶解性能很差,无法直接用于食品工业而大多由本实验室以淀粉糖生产中的米渣为原料通过纯化[1]用于动物饲料,蛋白资源未能得到有效利用。研方法制备;碱性蛋白酶(A1calase),系诺维信公司产究表明,碱法提取只能溶解其中约50%的蛋白质,碱品;凝胶Superdex200,瑞典Pharmacia公司产品。性蛋白酶水解也只能溶解70%的蛋白质,即这些蛋1.2主要仪器和设备白对酶表现出抵抗性。在营养学研究中也发
4、现了部Waters600高效液相色谱仪;凝胶柱色谱系统;分大米蛋白不被动物体内蛋白酶完全消化的现象,JascoJ-715圆二色谱仪;HP1100氨基酸分析仪。[2-3]其原因尚不清楚。大米谷蛋白主要由A(37ku)1.3实验过程和分析方法和B(22ku)两个亚基装配成寡聚体,且这些亚基与1.3.1酶水解物的凝胶柱色谱分析[4-5]大豆、燕麦和豌豆的球蛋白有很高同源性。但大凝胶柱100cm@1.0cm,填充剂Superdex200,用米蛋白不溶于水的原因及酶水解过程中这些组分的50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5)洗脱。取上清液变化规律等一直未见文献报道。用0.4
5、5Lm微孔滤膜过滤后,进入凝胶色谱柱分离,本研究的目的在于,通过研究大米蛋白的酶水上样量1.0mL。流速15mL/h,蛋白质检测波长:解机制,探讨大米蛋白因水解而溶解的规律,为进一220nm,样品收集15min/管。步实施大米蛋白的酶水解控制以获得有价值的目标1.3.2酶解物相对分子质量测定产物提供必要的理论依据。采用HPLC法,用Waters600高效液相色谱仪(配2487紫外检测器和M32工作站),TSKgel-2000SWXL300mm@7.8mm色谱柱,流动相为乙腈/水/基金项目:国家十五科技攻关项目(2001BA501A03)三氟乙酸,45/55/0.1(
6、V/V),流速0.5mL/min,柱温收稿日期:2006-05-09作者简介:王章存,男,1963年出生,教授,博士,粮油蛋白质工程30e,检测波长UV220nm。和农副产品深加工1.3.3SDS-PAGE分析6中国粮油学报2007年第4期参考文献6,采用Leammli系统,分离胶浓度为分的相对含量增加。12%,浓缩胶浓度为4%,考马斯亮蓝R-250染色。根据标准蛋白(系中科院上海生化所产品)的迁移率(Rf)及其相对分子质量对数绘制的标准曲线,计算样品中各亚基的相对分子质量。1.3.4氨基酸组成分析参考文献7。1.3.5圆二色(CD)光谱测定远紫外区190~250n
7、m范围的CD光谱,样品浓度0.3mg/mL,测定温度25e,比色皿光径1cm,分辨率0.2nm,谱带宽度为1.0nm,灵敏度为20mdeg,响应时间为0.25s,扫描速率为200nm/min,重复扫描8次,累加得到CD谱图。2实验结果与讨论2.1可溶物蛋白质的凝胶色谱分析将经过不同水解时间的酶解物上清液在Super-dex200凝胶柱色谱中用磷酸盐缓冲液洗脱,紫外光220nm检测洗脱组分并记录洗脱曲线,结果如图1所示。可以看出,随着水解时间的延长,色谱中主峰的洗脱体积有所增大,主峰面积也在增大,说明水解后多肽组分的相对分子质量变小或较小组分的含量增加。此时DH值
