实验二 特殊显微镜的使用——相差显微镜

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1、实验二特殊显微镜的使用实验2.1相差显微镜一、实验目的掌握相差显微镜的原理、构造及其使用方法。二、实验原理相差显微镜（phase-contrastmicroscope）是由P.Zernike于1932年发明的，P.Zernike于1953年获诺贝尔物理奖。相差显微镜最大的特点就是可以用于观察未经染色的标本和活细胞。人们在光学显微镜下观察被检标本时，只有在反射光的波长（颜色）和振幅（亮度）与周围介质有变化时，方能看到被检样品的结构。活细胞近于无色透明，光波通过时，透过或反射光的波长和振幅都不发生改变，所以用普通光学显微镜难以辨清活体

2、的结构。一般对于明暗对比很小的样品，多借助于固定和染色等理化方法，使样品和背景的反射或透射光在波长和振幅上发生变化，即在颜色和亮度上有所差异，才能识别。但有些样品一经染色就会引起变形，染色也可使有生命的样品死亡。我们可以利用相差显微镜来进行观察。相差显微镜利用了光的干涉现象，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，因此它是一种应用在染色困难或不能染色的新鲜标本上获得高对比图像的新型显微镜。相差方法应用于生物学上的主要价值，在于它能对透明的活体进行直接观察，无需采用使细胞致死的固定和染色的方法。染色给活体以有害的影响，甚至失真。由

3、此，才使相差法显得异常重要。相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位是指在某一时间上，光的波动所达到的位置。相差决定于光波所通过介质的折射率之差及其厚度，等于折射率与厚度的乘积之差（即光程之差），介质越厚或折射率越大，光波减速也越大。图1-10相差显微镜光路图为了达到相差效应，在相差显微镜的物镜中，装有由光学玻璃制成的相板（phaseplate）。在圆形相扳平面上，有一圈与周围（里外）相扳厚度不同的或凸或凹的圆环。相板分两部分：共轭面（conjugatearea）：通常为环状，是通过直射光的部分。其环是

4、凸起的，也可能是凹陷的。补偿面（complementaryarea）：共轭面内外两侧部分，是通过衍射光的部分。在相板的共轭面或补偿面上，涂有改变光波相位或吸收光线的物质。当光线通过时，使光波的相位或振幅改变，从而达到不同的目的与观察效果。利用相板把光波相位推迟，振幅改变。相板的作用，除推迟直射光和衍射光的相位之外有吸收光，从而使亮度改变的作用。物镜的后焦点位于透镜中间而相板位于物镜的后焦面上，所以相板安装在透镜中间。相差显微镜的光路图如图1-12所示，光线从聚光镜下的环状光阑的圆形缝隙射入直射光，照射到被检样品上，产生直射光和眼射

5、光两种光波。衍射光的振幅较小，相位滞后。在物镜的后焦面上，设有相板，直射光通过共轭面，衍射光通过补偿面，并相互干涉造像。样品的影像由直射光和衍射光经干涉后的合成波造成；背景仅由直射光形成。由于直射光和衍射光两种光波的相位差异不同造成不同的反差效果，或明反差或暗反差不等视所用物镜的相板类别而定。成像光束由物镜射入目镜，在目镜的视场光阑处再次放大。三、实验装置相差显微镜不同于普通光学显微镜，在装置上有四种必不可缺的部件：相差物镜、具有环状光阑的转盘聚光器、合轴调中望远镜和绿色的滤色镜。1．相差物镜（phasecontrastobjec

6、tive）相差物镜是显微镜特有的重要装置。在相差物镜内的后焦面上装有种类不同的相板。相板由于前述的作用，造成视场中被检样品影像与背景不同的明暗反差，各具不同的效果。因物镜内相板种类或构成的不同，物镜在明暗反差上可区分为两大类，即明反差（B）或负反差（N）物镜和暗反差（D）或正反差（P）物镜。物镜的反差类别，用英文字母B或N和D或P标志在物镜外壳上，并兼有高H（High）、中M（Medium）和低L（Low）等三种不同的反差。有的相差物镜用ph字样标示。同一反差类别的物镜，依放大率的不同，又可分为10×、20×、40×和100×数种

7、，因此相差物镜种类颇多，一套可多达20余种。相差物镜多为消色差物镜或平场消色差物镜（PL）。2．转盘聚光器（turretcondenser）图1-11转盘聚光器构造图位于镜台之下，普通聚光器的所在位置上由聚光镜和环状光阑（annulardiaphragm）构成。环状光阑位于聚光镜之下，是一种特殊的光阑装置，由大小不同的环状通光孔构成，不同规格的通光孔——环状光阑装配在一个可旋转的转盘上，按需要调转使用（图1-13）。环状光阑的环宽与直径各不相同，与不同放大率的相差物镜内的相板相匹配，不可滥用。转盘前端朝向便用者一面有标示窗（孔），

8、转盘上的不同部位标有0、1、2、3和4或0、10、20、40、和100字样，通过标示窗显现。“0”表示非相差的明视场的普通光阑。1或10、2或20、3或40和4或100，表示与相应放大率的相差物镜相匹配的相差物镜相匹配的不同规格的环状光阑的标志。通