倒置相差显微镜及荧光显微镜原理、使用与注意事项

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1、倒置相差显微镜及荧光显微镜的使用XXX,YYY,ZZZ(版权所有，仅限个人)1倒置相差显微镜倒置相差显微镜，是将相差显微镜和倒置显微镜相结合的产物，倒置相差显微镜既具有倒置显微镜的倒置观察方式，同时又具有与相差显微镜相一致的成像原理。因此，研究倒置相差显微镜的工作原理就需分别研究倒置显微镜和相差显微镜的工作原理。1.1倒置显微镜的工作原理：倒置显微镜组成和普通显微镜一样，主要包括三部分：机械部分、照明部分、光学部分。其中与普通显微镜有明显区别的是：物镜与照明聚光系统的相对位置。相比于普通显微镜，倒置显微镜的物镜与照明聚光系统以载物台为轴颠倒位置，物镜在载物台

2、之下，照明系统在在载物台之上。这样的构造使得照明聚光系统与载物台的有效距离可以显著扩大，便于放置培养皿、细胞培养瓶等较厚的待观察器具，而同时物镜与材料之间的工作距离不必很大。图1.1倒置显微镜由于倒置显微镜观察的材料一般都是培养的细胞，透明性大，结构对比不明显，故倒置显微镜常配备相差物镜，实际上也就构成了倒置相差显微镜（图1.1）。1.2相差显微镜的工作原理：1.2.1光学知识镜检时，视场中的样品只有在其透射光的波长（颜色）和振幅（亮度）与周围介质有明显变化时，才能被眼睛所分辨。照明光线通过无色透明的物体时，透射光的波长和振幅都不发生明显改变，尤其是振幅，几

3、乎无变化。所以用普通光学显微镜观察时，难以辨清这样物体的结构，必须借助于固定和染色等理化方法，使样品和背景的透射光在波长或振幅上发生变化，即在颜色和亮度上有所差异，以供识别。一束光线在透过折射率n不同的透明介质后，产生的衍射光和透过的直射光的波长没有明显变化，只是衍射光的振幅稍小于直射光，这也是透明不均质物质产生些许明暗变化的原因，但这一点变化很小，并不能有效分辨。变化明显的是衍射光相对透射光在相位上有1/4λ的滞后，虽然人眼不能分辨相位的差别，但可以分辨振幅和波长的变化。相差显微镜就是利用这一点，将相位的差别转变成振幅的变化，也就是将本来均为透明但折射率不

4、同的各个结构显现出明暗差距，从而可以被清楚地分辨。可见光光线通过介质水或其他小分子匀质物质时，由于介质分子远小于可见光波长，故而光的衍射现象并不明显，可以说透射光是直射光。但当可将光透过细胞结构或其他粒径与入射光波长相近的物质结构时，就会产生明显的衍射现象，透射光转化为衍射光。也就是说，细胞等常见观察物的结构大小刚好可以使可将光产生衍射现象。相差显微镜就是利用这一点。光波通过小颗粒的物体后产生直射光和衍射光，衍射光的光波振幅小，相位滞后。在光学系统中，这种直射光和衍射光相遇或光的叠加，振幅发生变化，光线或明或暗，就是光的干涉现象。1.2.2相差显微镜结构相差

5、显微镜不同于普通光学显微镜，在装置上有四种必不可缺的部件：相差物镜（内有相板）、具有环状光阑的转盘聚光器、合轴调中望远镜和绿色的滤色镜。1.2.2.1相差物镜（phasecontrastobjective）相差物镜与普通物镜的主要区别在于具有相板结构（图1.2），相板（phaseplate）是由光学玻璃制成的，利用光的衍射和干涉现象，将直射光和衍射光的相位差转变为振幅差。图1.2相差物镜（示相板）在圆形相板的平面上，有一圈与周围（里外）相板厚度不同的或凸凹的圆环（图1.3）。相板分两部分：（1）共轭面（conjugatearea）：通常为环状，是通过直射光的

6、部分。其环是凸起的，也可能是凹陷的。（2）补偿面（complemetaryarea）：共轭面内外两侧部分，是通过衍射光的部分。在相板的共轭面或补偿面上，涂有改变光波相位或吸收光线的物质，通常为氟化镁。当光线通过时，使光波的相位或振幅改变，从而达到不同的目的与观察效果。图1.3相板的种类及构造左上：吸收直射光的明反差相板平面和剖面图；左下：吸收直射光的暗反差相板剖面图；右上：吸收衍射光的明反差相板平面和剖面图；右下：吸收衍射光的暗反差相板剖面图；黑色：吸收光线层；浅色：推迟相位层；白色：玻璃。相板的种类比较多，对光的吸收率高低不同，所以产生不同的反差效果，从反

7、差上大致可分下列两类（图1.4）：（1）明反差（brightcontrast）或负反差（negativecontrast）：是指在相差显微镜的视场中，物像亮度大于背景亮度的现象。在被检物体的折射率大于周围介质时，直射光被相板的共轭面（因为在共轭面上涂有改变相位和吸收光线的物质）推迟1/4波长，同时吸收80%~90%，振幅变小，致使仅由直射光照射的背景变暗。通过补偿面的衍射没有变化，由于直射光推迟1/4波长，两者（直射光与衍射光）有完全相同的相位，合成波P等于直射光S与衍射光D之合，即P=S+D，故振幅加大。所以被检物体比只有直射光照射的背景亮得多。（2）暗反

8、差（darkcontrast）或正反差（positi