海洋生物技术概论

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1、第一章细胞培养：所谓细胞培养是指将有机体内的某一组织，如动物的肝、肾或肌肉等取出，分散成单个细胞，在人工条件下使其存活、生长和分裂的技术。细胞培养：使用单个细胞悬液(是把取得之组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液，然后进行培养生长。)组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2毫米）(把活体的一小片组织置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长)器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫(系将活体中器官或一部分器官取出，置于体外生存、生长并同时保持其一定的结构和功能特征。)原代培养：取

2、自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养（在培养条件下传１至１０代）。传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中（一般可传４０至５０代的细胞）。细胞株（cellstrain）：原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞的生长就要出现停滞，大部分细胞衰老死亡，但有极少数细胞可能度过危机而传下去。这些存活的细胞一般又可顺利地传40-50代次。并且保持原来的染色体的二倍体数量及接触抑制的行为。此类细胞成为细胞株。从一个经过生物学鉴定的细胞系由单细胞分离培养

3、或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群称细胞株(cellstrain)。所以细胞株是通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞。从培养代数来讲，可培养到40-50代。8细胞系（cellline）：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果不能继续传代，或传代次数有限，可称为有限细胞系(finitecellline)，如可以连续培养，则称为连续细胞系(continuouscellline)，培养50代以上并无限培养下去。当细胞

4、株传至50代以后又要出现危机，不能再传下去了。但有部分发生了遗传突变，并带有癌变的特点，这种细胞有可能在培养条件下无限地传下去，这类细胞称为细胞系。9原代培养细胞的生命归宿l原代培养期l传代期l衰退期10培养细胞的生长方式贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长,见于各种实体瘤细胞;悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面,见于各种造血系统肿瘤细胞。11贴附生长细胞的生长过程游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束

5、。细胞株平均在10分钟—4小时贴壁。潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂，机制：接触抑制、密度依赖性。12血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）。13培养细胞生长的条件1细胞的营养需要

6、2细胞的生存环境温度:37℃O2（培养液与液面上的空间比1：10或2~5mm，95%或100%饱和氧）CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4渗透压3无污染4无毒14细胞培养所需实验条件实验用品：超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器等CO2培养箱倒置显微镜液氮罐耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广电热干燥箱：干热消毒（160℃，2小时）。主要用于玻璃器皿消毒滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶

7、液等均采用滤过法除菌超净工作台：为细胞操作提供无菌环境紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2。15使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90℃，14h)。③箱内放3000毫升灭菌蒸馏水，以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。16细胞培养用液的配制水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl8.0gKCl0

8、.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20加水至1000ml17消化液胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用18培养基培养基