产枯草芽孢杆菌实训报告

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1、生化工艺实训报告一产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的优化1、产淀粉酶枯草芽孢杆菌斜面活化2、摇瓶发酵优化培养基及种子培养3、葡萄糖标准曲线的制备4、发酵参数的测定1、产淀粉酶芽孢杆菌斜面活化实验材料菌种：从土壤中分离产淀粉酶的枯草芽孢杆菌配方：牛肉膏蛋白胨培养基蒸馏水400ml、牛肉膏2g、蛋白胨4g、氯化钠2g、琼脂0.2g、PH7.0~7.2试剂：牛肉膏、氯化钠、氢氧化钠溶液、蛋白胨、琼脂、盐酸溶液实验内容1、制备培养基：依照培养基组成稀释后定容400ml，分装与6个摇瓶中，50ml。剩余溶液分装与6个试管中，均10ml，并加0.2g琼脂。2、灭菌：高压灭菌锅

2、121摄氏度0.11MPa20~30min3、斜面摆放：灭菌后的试管静止冷却至50摄氏度左右，将试管的液面及搁置的试管斜面长度不超过试管总长一半，凝固后待用。4、斜面活化：在超净工作台中将保藏的芽孢杆菌接种置已制好的斜面上划线。5、恒温培养：恒温培养箱37摄氏度过夜培养进行活化2、摇瓶发酵优化培养基实验材料试剂：牛肉膏蛋白胨氯化钠淀粉葡萄糖仪器设备：分光光度仪、超净工作台、烧杯、摇瓶、电炉、斜面活化的菌种、牛肉膏蛋白胨液体培养基、玻璃棒等玻璃仪器实验步骤：恒温水浴锅分光光度计1、摇瓶发酵培养基优化发酵优化方案葡萄糖g淀粉g蛋白胨g牛肉膏g氯化钠溶液ml蒸

3、馏水mlPH值接种量%摇瓶装量方案12——20.050.51007.0~7.2250方案22——10.050.51007.0~7.2250方案3111.50.050.51007.0~7.2250方案41.50.51.50.050.51007.0~7.2250方案52——1.50.050.51007.0~7.2250方案62——1.50.050.51007.0~7.2450摇瓶发酵培养基优化实验步骤依照优化培养基配方制备相应试剂，每个配方平行试验两次灭菌：将12个摇瓶与高压蒸汽灭菌锅内进行灭菌121摄氏度0.11MPa15~20min种子培养接种：选取生长

4、状况良好的试管斜面进行接种，挑取活化菌接种到液体培养基中，平行6个培养条件：37摄氏度摇床培养注意事项：确保在灭菌环境中进行对培养基进行标注，以免混淆3、葡萄糖标准曲线的制备试验步骤1）DNS试剂的制备：称取3.25gDNS溶与热蒸馏水中，加入2mol/L氢氧化钠溶液162.5ml，再加入22.5ml丙三醇，摇匀，冷却后定容500ml，待用。2）葡萄糖标准试剂待用中3）在下述试管中分别加入DNS试剂2ml于沸水浴中加热2min进行显色，取出后立即冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在分光光度计中540nm波长处测定光吸收值。4）以葡萄糖含量为横坐标，光吸

5、收值为纵坐标，绘制标准曲线管号葡萄糖标准液蒸馏水葡萄糖浓度OD540001.00010.20.80.40.02020.40.60.80.05030.60.41.20.06440.80.21.60.09051.002.00.127葡萄糖标准溶液葡萄糖标准曲线3、发酵参数的测定实验步骤在超净工作台上将方案1、2、3、4、5均按2%接种量进行接种，在180r/min的摇床进行培养；方案6接种4%在120r/min的摇床上进行培养。每隔一小时进行取样（包含0小时），检测酶活、菌浓、及其PH值。根据各数据挑选最优培养方案。生长曲线绘制将取样稀释后与分光光度计（波长

6、600nm）测OD值，空白为蒸馏水。绘制生长曲线，横坐标为培养时间，纵坐标为菌浓。生长曲线参数数据时间波长蛋白胨2g方案1蛋白胨1g方案2淀粉1g方案3淀粉0.5g方案4接种量2%方案5接种量4%方案60时600nm处OD值0.1540.090.1760.1920.0770.221时0.2220.170.2340.2280.1680.2462时0.2680.220.2460.4510.2460.3643时0.3080.2280.340.5520.260.3854时0.3360.2640.5850.5920.2920.396生长曲线酶活测定发酵液离心处理8

7、000rpm5min1ml离心后的上悬液加入5ml1%淀粉溶液与37摄氏度水浴5min，然后沸水浴5min，终止反应。取上述溶液1ml加入DNS试剂2ml与沸水浴加热，2min进行显色反应，取出后迅速冷却，各加入9ml蒸馏水，摇匀，在540nm波长处测光吸收值。以发酵液加1%淀粉溶液直接加热，煮沸后再加2mlDNS试剂，作为空白。酶活测定参数数据时间蛋白胨2g方案1蛋白胨1g方案2淀粉1g方案3淀粉0.5g方案4接种量2%方案5接种量4%方案60时13.0588.1265.3229.66211.85113.511时14.59111.1538.7688.6

8、8025.59614.1132时23.37212.2213.96418.0643