碱性磷酸酶km值测定

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1、酶促反应动力学研究方法介绍EXPERIMENT3碱性磷酸酶km值测定实验目的学习环境因素对酶促反应速度的影响;学习米氏方程及Km值得测定;测量碱性磷酸酶km值;实验原理E的反应速度受到环境因素的影响,这些因素包括底物浓度、E浓度、PH、温度、激活剂、抑止剂等(一)米-曼氏方程式中间产物酶促反应模式——中间产物学说E+Sk1k2k3ESE+P相关E学原理※1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式,即米-曼氏方程式(Michaelisequation)。[S]:底物浓度V:不同[S]时的反应速

2、度Vmax:最大反应速度(maximumvelocity)Km:米氏常数(Michaelisconstant)VVmax[S]Km+[S]=──米-曼氏方程式推导基于两个假设:(1)E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应,而ES分解为E及P的反应为慢反应,反应速度取决于慢反应即V=k3[ES]。(2)S的总浓度远远大于E的总浓度,因此在反应的初始阶段,S的浓度可认为不变即[S]=[St]。推导过程稳态:是指ES的生成速度与分解速度相等,即[ES]恒定。K1([Et]-[ES])[S]=K2[ES]+K3[ES]K2+K3=Km

3、(米氏常数)K1令:则(2)变为:([Et]-[ES])[S]=Km[ES](2)=([Et]-[ES])[S]K2+K3[ES]K1整理得:当底物浓度很高,将酶的活性中心全部饱和时,即[Et]=[ES],反应达最大速度Vmax=K3[ES]=K3[Et](5)[ES]=───[Et][S]Km+[S](3)整理得:将(5)代入(4)得米氏方程式:Vmax[S]Km+[S]V=────将(3)代入(1)得K3[Et][S]Km+[S](4)V=────当反应速度为最大反应速度一半时Km值的推导Km=[S]∴Km值等于酶促反应速度

4、为最大反应速度一半时的底物浓度,单位是mol/L。2=Km+[S]VmaxVmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2(二)Km与Vmax的意义Km值①Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。②意义:a)Km是酶的特征性常数之一;b)Km可近似表示酶对底物的亲和力;c)同一酶对于不同底物有不同的Km值。Vmax定义:Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度,与酶浓度成正比。意义:Vmax=K3[E]如果酶的总浓度已知,可从Vmax计算酶的转换数(turnovernumber),即动力学常数K3。定义—当酶被底物充分饱和时

5、,单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。意义—可用来比较每单位酶的催化能力。酶的转换数(三)Km值与Vmax值的测定双倒数作图法(doublereciprocalplot)-1/Km1/Vmax1/[S]1/VVmax[S]Km+[S]V=林-贝氏(Lineweaver-Burk)方程+1/V=KmVmax1/Vmax1/[S]两边同取倒数Hanes作图法[S][S]/V-KmKm/Vm在林-贝氏方程基础上,两边同乘[S][S]/V=Km/Vmax+[S]/Vmax酶浓度对反应速度的影响当[S]>>[E],酶可被底物饱

6、和的情况下,反应速度与酶浓度成正比。关系式为:V=K3[E]0V[E]当[S]>>[E]时,Vmax=k3[E]酶浓度对反应速度的影响双重影响温度升高,酶促反应速度升高;由于酶的本质是蛋白质,温度升高,可引起酶的变性,从而反应速度降低。温度对反应速度的影响最适温度(optimumtemperature):酶促反应速度最快时的环境温度。*低温的应用酶活性0.51.02.01.50102030405060温度ºC温度对淀粉酶活性的影响pH对反应速度的影响最适pH(optimumpH):酶催化活性最大时的环境pH。0酶活性pHpH对某

7、些酶活性的影响胃蛋白酶淀粉酶胆碱酯酶246810碱性磷酸酶km值的测定以不同浓度的磷酸苯二钠作为碱性磷酸酶的底物,在最适条件下(pH=10.0,37℃),准确反应15min。在碱性条件下产物酚可以与酚试剂作用生成蓝色化合物,该蓝色化合物在650nm波长比色,色泽深浅与光密度成正比。反应式如下:然后,以吸光度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度,即以吸光度的倒数作纵坐标以底物浓度的倒数作横坐标,按Lineweaver-Burk作图法求出Km值。1.酚试剂2.2.5mmol/L磷酸苯二钠基质液3.碱性缓冲液(pH-10.0)4.碱性磷

8、酸酶液【试剂】称取磷酸苯二钠635mg,用蒸馏水溶解后定容至1000ml,加氯仿数滴以防腐,置于冰箱中可保存1年之久。称取无水Na2CO36.36g和NaHcO33.36g,先以适量蒸馏水溶解,再定容至1000ml。称取碱性磷酸酶lmg,加水3~4ml,置于冰箱

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