甘薯蛋白抗癌作用研究进展

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1、甘薯蛋白抗癌作用研究进展汇报内容立题依据1总结4研究内容和技术路线2研究结果3立题依据我国甘薯（Ipomoeabatatas）产量世界第一（约1亿吨/年），其中约50%用于生产淀粉、粉丝等初级产品，附加值低，加工过程中产生大量废液、废渣。废液中含1%左右可溶性蛋白，直接排放不仅浪费资源，而且污染水质，亟待解决。甘薯块根中特有的贮藏蛋白Sporamin占其蛋白总量的60-80%，本实验室前期研究表明，Sporamin能显著抑制人结肠癌HCT-8细胞在裸鼠腹腔内的弥散性生长，并抑制皮下接种的Lewis肺癌细胞在C57黑鼠体内自发性的肺转移。因此，本课题继续对

2、sporamin的抗癌作用及其细胞内分子作用机制进行了探索。研究内容细胞实验：观察甘薯蛋白对3种癌细胞（人结肠癌HT-29细胞、HepG2肝癌细胞、Bcap-37乳腺癌细胞）增殖及转移扩散能力的抑制作用，并探索其相应的细胞内信号转导机制。临床试验：观察甘薯蛋白（SPP）与5-氟尿嘧啶（5-FU）联用治疗人结肠癌的安全性及有效性。本研究意义在于：探索甘薯蛋白在防治恶性肿瘤方面的作用和应用价值，为开发新型抗癌药物奠定基础。提高甘薯加工的利用率和产品附加值。有助于解决我国甘薯淀粉加工业废水污染环境的问题。研究意义技术路线目的：观察甘薯蛋白对3种恶性肿瘤细胞增殖

3、及侵袭转移能力的抑制作用，探索其细胞内分子作用机制。实验内容：MTT结晶紫染色荧光染色划痕愈合实验抗粘附实验明胶酶谱试验uPA分泌量测定(ELISA)免疫印迹RT-PCR细胞培养：从中国科学院细胞库购买各种肿瘤细胞株，按照推荐的方法采用合适的培养基和培养条件在二氧化碳培养箱（37°C，5%CO2）中培养。条件培养液（CM）的制备：肿瘤细胞株在培养板中长满后，换成1%小牛血清的培养液并移入可调节氧气浓度的CO2培养箱中继续培养24时，24小时后取出培养板，吸出上清液冻干后备用。MTT法细胞生长分析：将肿瘤细胞接种于96孔板（10，000cells/well

4、），加含10%胎牛血清的完全培养基培养24h，然后将培养基换成含有或不含有各种处理试剂的RPMI1640培养基。分别在换液后的1、3、5天测定细胞增殖情况，采用MTT法，加入20μgvital染料MTT（1mg/ml）后继续培养4h，被细胞吸收的蓝色染料用DMSO（100μl/well）溶解，测定其在490nm处的吸光度。正式实验前先做预实验检查吸光度和细胞数量之间是否成正比。试验方法划痕愈合实验：将细胞按1-5x105个/孔的密度接种于12孔培养板；形成单层细胞后，用20-200微量pipette管尖端刮一个宽1mm的划痕；用新鲜培养基洗两次，然后换成

5、含不同浓度甘薯蛋白的培养基，37℃孵育20h后用PBS冲洗，4％多聚甲醛固定，在刮伤0h和20h后分别照相（放大100倍），用ImageJ图像软件计算刮口的平均距离。细胞愈合划痕的能力用它们的运动距离表示，计算方式如下：（0h时划痕的平均距离-20小时后划痕的平均距离/0h时划痕的平均距离）×100。抗粘附试验：将细胞接种到24孔板或6孔板，形成单层细胞后脱血清过夜培养，换含不同浓度甘薯蛋白和PMA的培养基处理24h，然后用PBS冲洗2遍，加入200或500μL0.25%trypsin/0.1mMEDTA，室温，100RPM振荡消化细胞，记录细胞完全脱落

6、需要的时间.酶谱法测定MMPs和uPA的活性：分别用明胶酶谱和纤溶酶原-酪蛋白酶谱法测定条件培养基中分泌的MMPs和uPA的活性，用含或不含100ng/mlPMA及不同浓度甘薯蛋白的培养基处理细胞4h，收集培养基，过滤除去悬浮细胞，用浓缩离心管浓缩25-50倍，各组取等量培养基与不含SDS和β-mercaptoethanol的样品缓冲液混合后上样，用含2mg/ml明胶的10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳结束后将凝胶置于复性缓冲液液（2.5%Triton-X100）中震荡洗脱30min×4次；明胶孵育液（50mmol/LTris-HCl、10mmol/L

7、CaCl2、200mmol/LNaCl、1μmol/LZnCl2）37℃孵育24h，考马斯亮蓝染液染色2h，脱色30～40min。分析凝胶图像，应用ImageJ软件读取条带面积和酶解条带灰度，酶含量=条带面积×（条带灰度－背景灰度），以样本酶含量/对照样品酶含量比值表示样本的酶活性值。uPA酶谱做法与MMPs相似，只不过用1mg/ml酪蛋白(MPBiomedicals,Inc.,Irvine,CA)和1U/ml纤溶酶原(MPBiomedicals,Inc.)代替了明胶。试验方法条件培养基中uPA分泌量的测定：采用ELISA法，根据试剂盒(CusabioB

8、iotech,China)说明书进行测量。免疫印迹（WesternBlottin