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1、操作中的注意事项及解释1.为提高分子间连接的效率,连接反应中cDNA的浓度要低,因为高浓度的cDNA可能会提高非同源连接水平,从而产生非特异扩增.2.成环的双链cDNA进行裂解和变性比较重要,因为环状双链DNA分子易于形成超螺旋而不利于PCR反应,它只可以扩增出较短的DNA片段.3.现认为下列方法可在成环的DNA分子中引入切割:3.1最常用的简便办法是煮沸,但因为某些环状双链DNA分子不时形成不太普遍的二级结构,使得该方法在使环状双链DNA分子变性和引入切刻时并不很奏效.3.2第二种办法是选用核酸内
2、切酶进行消化,理想的限制位点应位于已知序列内,但在多数情况下,由于cDNA未知已域内酶的限制图谱并不清楚,所以很难选择用何种限制酶.3.3如果没有合适的限制性酶可用,也可以尝试使用EDTA-寡核苷酸-介导的特异裂解办法.T处连有EDTA-Fe的寡核苷酸通过与双链DNA形成三股螺旋而特异地结合于双链DNA某一区段,这样就可以在结合位点裂解双链DNA.4.碱变性法已成功地用于制备PCR和测序用质粒DNA,该方法也可以有效地使环化的双链cDNA实现变性.5.加入T4RNA连接酶或氯化六氨合高钴可以提高T4
3、DNA连接酶催化的双链DNA平齐末端连接的效率.6.IPCR法可以有效地用于快速扩增任何已知片段cDNA或基因组DNA两侧的未知序列,它不需要构建或筛选DNA文库来获得未知序列信息.有些重组的噬菌体或质粒在细菌内部不稳定,所以扩增后的文库可能会丢失这些部分,然而PCR法不存在这个问题.详细资料一,DNA的酶切已知序列和两侧未知序列的酶切图及环化的DNA大小是影响IPCR限制性内切酶选择的关键.多数情况下,可以通过对已知序列的分析或用DNA印迹杂交法确定限制性酶切位点和片段长度来决定选择哪种内切酶.为
4、了获得已知序列上下游的未知序列可用一种或多种在已知序列内没有切点的限制性内切酶消化样品DNA,这时,如果产生的切段末端不互补,可以用Klenow或T4聚合酶填平末端后再行连接.因为PCR扩增长度所限,所以要求酶切到的目的片段长度不得超过核心区的2-3kb.选择好合适的内切酶后,用常规酶切法消化染色体,消化产生可直接用于下述连接反应.但某些情况下,如已知序列拷贝数很高,而且预计扩增未知序列大小不明时,应先将已知序列分离出来.二,酶切片段的环化用1μg的酶切DNA进行连接环化就可用于分析,环化前先用酚-
5、氯仿抽提,乙醇沉淀纯化酶切片段,晾干沉淀的DNA片段,用连接缓冲液(50mmol/LTris-HCl,pH7.4;10mmol/LMgCl2;10mmol/LDTT和1mmol/LATP)溶解.浓度应小于2μg/ml.然后加入T4DNA连接酶0.02U/mL(Weiss单位),15℃放置16小时.另外,酶切片段也可以不用酚-氯仿法来灭活内切酶而用连接缓冲液稀释5倍以上的方法进行,再加入连接酶进行环化反应,但这时,酶切体积要小.三,PCR向环化DNA混合液加入盐后用乙醇沉淀,并溶于10μl去离子水.环
6、化DNA分子在标准PCR应体系中可用与已知序列两侧互补的反向引物来扩增未知序列.环化分子扩增时也可以不用酶切线性化,因为数个循环后就可以产生线性模板分子.用于IPCR的引物也可在5'端修饰后进行不同目的的扩增.四,IPCR的应用最初IPCR法是用来快速扩增任何一个已知基因片段两侧未知序列,比较适于扩增中度重复DNA序列.也可以用YAC载体的一个臂中的已知序列来扩增插入片段的特异末端,得到的定向特异DNA片段可用作杂交探针来筛选YAC文库中的重叠和紧邻克隆片段.五,IPCR技术的局限性由于IPCR的侧
7、翼序列未知,因此需选择合适的内切酶,但许多常用的内切酶在插入序列上有切点而且在载体上不合适位置也有切点,因此给酶的选择带来许多困难.参考文献BruceA.White.etal.PCRCLONINGPROTOCOLS,289~294.林万明,《PCR技术操作和应用指南》,1993年第一版,68~70.原理 反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补，但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶
8、切样品DNA，然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子，通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段；现已制备了酵母人工染色体（YAC）大的线状DNA片段的杂交探针，这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。 反向PCR原理图编辑本段不足之处 该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而
