食源性疾病药敏试验

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1、2014年食源性致病菌药敏实验操作北京市疾病预防控制中心营养与食品卫生所王迪抗生素的选择选择依据临床与实验室标准化协会（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI）推荐的药敏试验抗生素选择原则确定耐药监测的抗生素名单。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗生素种类不同革兰氏阴性菌抗生素的选择致病菌序号抗生素名称沙门大肠（5种）副溶志贺氏菌中文英文缩写1头孢西丁CefoxitinCFX2头孢噻肟CefotaximeCTX3四环素TetracyclineTET4庆大霉

2、素GentamicinGEN5氯霉素ChloramphenicolCHL6环丙沙星CiprofloxacinCIP7萘啶酸NalidixicacidNAL8甲氧苄啶/磺胺甲恶唑Trimethoprim/SulfamethoxazoleTMP/SMZ革兰氏阳性菌抗生素的选择致病菌序号抗生素名称中文英文缩写1苯唑西林OxacillinOXA2万古霉素VancomycinVAN3四环素TetracyclineTET4红霉素ErythromyciERY5氯霉素ChloramphenicolCHL6克林霉素Cl

3、indamycinCLI7环丙沙星CiprofloxacinCIP8甲氧苄啶/磺胺甲恶唑Trimethoprim/SulfamethoxazoleTMP/SMZ抗生素的选择表中推荐的抗生素为必做项目监测手册建议各省结合实际情况增加抗生素种类本实验室仅选择了以上表中的抗生素，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌各8种。检测方法CLSI推荐的体外抗生素敏感性试验方法1.稀释法（琼脂稀释法或肉汤稀释法）琼脂稀释法常量肉汤稀释法微量肉汤稀释法2.扩散法（diskdiffusion,K-B）检测方法食源性致病菌监测和食源

4、性疾病监测的要求：通过方法的统一标准化得到具有可比性的结果手册中要求采用微量肉汤稀释法定量测定最低抑菌浓度（MIC）检测方法-微量肉汤稀释法实验室购置抗生素标准品，配置储存液，制备96孔药敏板（操作复杂，不同抗生素储存液的保存条件和时限不同，手工稀释可靠性重复性相对较差）全自动药敏试验菌液接种判读仪（商品化药敏板，操作简单，结果稳定，重复性好，一次可处理大量样本，需购置仪器）商品化的96孔药敏板（商品化药敏板，操作简单，无需配置抗生素储存液）检测方法-微量肉汤稀释法质控菌株的选择革兰氏阴性菌-ATCC

5、25922革兰氏阳性菌（金葡菌）-ATCC29213实验流程-菌株活化前提：分纯的菌落1.待测菌株和质控菌株接种BHI肉汤，37℃过（18-24小时）培养。（第1天）2.从过夜培养的BHI肉汤管中挑取菌液，划线接种BHA平板，37℃过夜培养。（第2天）3.从过夜培养的BHA平板上挑取单个菌落，再次划线接种BHA平板，37℃过夜培养。（第3天）注意：副溶血性弧菌的BHI和BHA需要含有3%的NaCl实验流程-制备菌悬液无菌棉签挑取上述经2次活化的菌落（待测及质控）≥3个，用2mL无菌生理盐水充分混匀（管

6、壁充分研磨）调整菌悬液浓度为0.5麦氏单位（梅里埃的浊度计）吸取100μL菌悬液于10mLCAMHB肉汤中混匀，15min内使用，超过15min重新配置注意：1.研磨不开的菌落通过涡旋震荡处理2.至少挑取3个菌落制备菌悬液，防止耐药质粒的丢失实验流程-菌液接种药敏板将与CAMHB肉汤混匀好的菌液接种到药敏板中不同品牌的商品化药敏板的加样量不同，按照提供的操作说明进行操作注意：1.加样需使用带无菌滤芯的吸头2.吸头不要接触孔内的冻干药粉，避免药物的相互作用3.加样过程尽量快，30-60秒接种完毕，保持菌

7、液的均匀性4.从低浓度至高浓度一次加入，减少药物的相互作用，避免药物浓度受影响实验流程-培养温度：36±1℃时间：18±2h培养箱中放置水槽（盛水的烧杯），保持培养箱中的湿度，防止加样孔中的水分蒸发。一旦蒸发无法判读结果。药敏板尽量不要叠放，如果培养箱空间不够需要叠放，药敏板叠放不要超过4个实验流程-结果判读黑背景自然光线下肉眼观察1.细菌生长的小孔：弥散状浑浊或小孔底部有圆形或网状沉淀2.无细菌生长的小孔：清澈透明无细菌生长的孔内所含最低抗菌药物浓度即为MIC实验流程-结果判读注意事项同时满足生长孔

8、细菌明显生长，空白对照孔无细菌生长，质控菌株的MIC值在规定的质控范围内，结果可接受，否则重新试验TMP/SMZ：以细菌生长数量较生长对照孔有80%或80%以上的减少为结果终点MIC跳孔：出现单一跳孔，记录抑菌生长的最高药物浓度；出现多次跳孔，重复试验商品化药敏板使用前要观察孔中的抗生素粉末是否有洒落，如果洒落不得使用。商品化药敏板储存在-20℃冰箱中，平放，标签在上实验流程-结果判读注意事项向药敏板生产方索要抗生素浓度表和质控表结果记录：敏感（S）中介